隐形嵌合抗原受体及其减少对正常细胞的细胞毒性的用途制造技术

本申请涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶标依赖性开关CAR。本发明专利技术的CAR可以减少对正常细胞的细胞毒性并改善CAR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】隐形嵌合抗原受体及其减少对正常细胞的细胞毒性的用途
[0001]本申请要求于2020年8月19日提交的标题为“靶标依赖性开关嵌合抗原受体”的美国临时专利申请号63/067,870的权益；将该专利的内容通过援引以其全文并入本文。


[0002]本申请涉及生物制药领域，并且特别地涉及隐形嵌合抗原受体(CAR)及其相关多核苷酸、载体、组合物、制备方法和用途。

技术介绍

[0003]CAR T细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗中的初步成功预示了免疫治疗性治疗策略的新领域的快速发展。CAR是设计受体，其典型地具有衍生自CD3ζITAM基序的模块化激活结构域和例如来自4
‑
1BB或CD28的共刺激结构域。由这些受体进行的靶标识别通常通过CAR的细胞外末端的scFv结构域提供，尽管也设计了可替代方法。
[0004]安全性是阻碍CAR
‑
T疗法发展的主要障碍。CAR分子通常组成型地表达在T细胞表面上。因此，当将CAR
‑
T细胞注射到患者体内时，它们将迁移到表达靶抗原的不同组织，通常对正常组织以及肿瘤细胞具有非预期的毒性和损害。此外，CAR分子的组成型表达促进紧张性信号传导和T细胞耗竭。
[0005]迄今为止，已经开发了几种类型的开关来控制CAR
‑
T活性。这些开关中的一些开关是基于将“自杀基因”掺入到CAR构建体中。例如，已将HSV
‑
TK转基因用于过继细胞疗法以允许在用更昔洛韦治疗时经修饰细胞的诱导型细胞凋亡。另一方法依赖于使用诱导型半胱天冬酶9(iCasp9)。在这些策略中，通过靶向消除CAR
‑
T细胞本身来终止治疗性应答。
[0006]其他开关系统依赖于受体的修饰，例如，衔接子介导的CAR(也称为“通用CAR”)。这些CAR T细胞共享共同的受体，该受体可以经修饰以通过使该受体与结合CAR和肿瘤靶标两者的衔接子分子连接来识别多种肿瘤靶标。类似地，已经提出了经由药物诱导的二聚体将细胞内信号传导结构域募集到CAR的跨膜组分，作为控制给药和激活的手段。虽然目前临床上批准的CAR被设计为具有组成型活性，但衔接子依赖性CAR T细胞只能在施用衔接子时识别和杀伤，从而允许对CAR
‑
T细胞进行可滴定的和可逆控制。
[0007]对于这些类型的开关，CAR的表达和功能性是通过应用小分子药物或其他治疗剂进行外部调节的。这些类型的开关的主要挑战包括：可以应用的现有FDA批准的开关分子的可用性、开关分子的安全性特性、生物利用度、生物分布、以及由于开关分子和CAR
‑
T细胞的复杂动力学和分布而导致的体内调节复杂性。
[0008]通过靶向单个肿瘤相关抗原(TAA)对靶细胞群产生的选择性压力最终导致靶抗原的下调和CAR T细胞免疫应答的逃逸1(Ruella和Maus，2016)。靶抗原表达的丧失导致肿瘤细胞扩增未缓解，并最终导致疾病复发。研究已报告，在初级TAA下调时，靶细胞可能会上调次级TAA，从而允许第二轮治疗性干预2(图1)(Fousek等人，2020)。理想情况下，只有在肿瘤细胞群上调次级TAA时，才应靶向该次级TAA，以降低治疗性毒性。
[0009]高亲和力IL2受体是一种跨膜受体，其由三种不同的非共价缔合的组分构成：α、β
和γ链。已经表明，在α和γ亚基不存在的情况下，β链被组成型地内吞并降解3(H
é
mar等人,1994)。
[0010]LDLR的C
‑
末端残基的分析表明存在内体分选基序NDXY。研究表明，该基序通过与ARH的相互作用和与AP
‑
2复合物的结合介导间接内体分选机制4‑5(Tao等人,2016；Fasano等人,2009)。SEZ6L2的特征是其c
‑
末端区域中存在两个内体靶向共有序列6(Bonifacino等人,2003)。
[0011]本申请旨在通过提供用于减少对正常细胞的细胞毒性的隐形CAR来解决CAR
‑
T的安全性问题。

技术实现思路

[0012]在本申请的新颖的CAR系统中，CAR分子的表达/稳定化取决于靶抗原的可用性。当没有可用的抗原时，T细胞表面上没有可检测的CAR，并且没有CAR功能。当工程化的T细胞识别其靶抗原时，CAR被稳定化并且可以启动信号传导。这是一种靶标依赖性开关。通过调节应答抗原的CAR表达，本申请可以减少CAR T细胞毒性和耗竭。由于CAR在没有抗原的情况下是“不可见”的，因此本申请的专利技术人选择将其命名为“隐形CAR”。隐形CAR可以应用于单特异性和双特异性CAR的情况中、以及自体和同种异体的情况中。它可以在T细胞、NK细胞、γδT细胞、和iPSC衍生的T细胞的背景下应用。
[0013]内吞隐形CAR系统也可以应用于解决CAR T疗法面临的特定挑战，即“中靶、脱肿瘤”效应。由于TAA在肿瘤组织上通常会上调，但在正常组织上也以较低水平表达，因此，CAR T疗法可能具有靶向非癌细胞的不想要的效应。通过使用由抗原表达稳定的CAR，表达高水平靶抗原的细胞(例如，肿瘤细胞)为我们的CAR系统提供了更强的激活。因此，本申请可以促进CAR T细胞的肿瘤特异性杀伤，同时最大程度减少对正常组织的影响(图2)。在组合模型中，两种CAR都可以是内吞类型的，最大程度减少中靶、脱肿瘤效应，并解决了抗原逃逸。
[0014]通过在双重特异性的情况中应用隐形CAR，本申请预期该系统可用于解决抗原逃逸问题。通过在细胞表面处表达仅瞬时稳定的CAR变体，本申请提供了减少附带靶向和损伤正常组织的机制。肿瘤细胞上次级靶抗原的上调提供了更强的信号并促进CAR表面稳定性和下游激活。通过用一种CAR靶向初级TAA并用第二隐形CAR靶向次级TAA，本申请可以引起强烈的初始肿瘤应答并且仅在次级TAA上调时才引起靶向的次级应答。
[0015]本申请的专利技术人设计并制备了几种具有修饰的跨膜和近膜序列的CAR变体，这些序列促进受体的细胞内运输。这些序列衍生自IL2受体β链(IL2Rβ或IL2Rb)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和人癫痫发作6样蛋白2(SEZ6L2)。这些受体的跨膜和细胞内序列中的氨基酸基序经由内体途径促进细胞内运输。
[0016]本申请提供了新颖的隐形CAR，用于减少对正常细胞的细胞毒性和改善CAR
‑
T安全性、以及减少由组成型CAR表面表达引起的炎症性细胞因子和紧张性信号传导。本申请还提供了包含隐形CAR和第二CAR的双重CAR，以及包含编码隐形CAR或双重CAR的多核苷酸的相关核酸、载体、宿主细胞和药物组合物。本申请进一步提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物；一种减少CAR
‑
T细胞对正常细胞的细胞毒性的方法；以及一种产生对正常细胞的细胞毒性减少的CAR
‑
T细胞的方法。
[0017]在一个方面，本申请提供了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含：(1)细胞外配体结合结构域，其包含与预定抗原特异性结合的单链可变片段(scFv)；其中优选地，该预定抗原是肿瘤相关抗原(TAA)；更优选地，该TAA选自以下中的一种或多种：CEA、密封蛋白18.2、CGC3、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、CD38、CD19、CD20、CD22、BCMA、CAIX、CD446、CD13、EGFR、EGFRvIII、EpCam、GD2、EphA2、HER1、HER2、ICAM
‑
1、IL13Ra2、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NY
‑
ESO
‑
1、MART
‑
1、WT1、MAGE
‑
A10、MAGE
‑
A3、MAGE
‑
A4、EBV、NKG2D、PD1、PD
‑
L1、CD25、IL
‑
2、和CD3；(2)跨膜(tm)连接近膜(jm)结构域；其中该跨膜连接近膜结构域包含IL2受体β链(IL2Rβ)跨膜结构域和IL2Rβ近膜结构域，并且该跨膜连接近膜结构域与IL2Rβ降解序列(DT)相邻；其中优选地，该IL2Rβ降解序列在该跨膜连接近膜结构域的C
‑
末端处；其中优选地，该IL2Rβ降解序列包含与由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中该跨膜连接近膜结构域包含低密度脂蛋白受体(LDLR)跨膜结构域和LDLR近膜结构域；或其中该跨膜连接近膜结构域包含癫痫发作6样蛋白2(SEZ6L2)跨膜结构域和SEZ6L2近膜结构域；(3)细胞内结构域；其中优选地，该细胞内结构域包含信号传导结构域；更优选地，该信号传导结构域包含一个或多个选自由以下组成的组的信号传导结构域：4
‑
1BB信号传导结构域、CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。2.根据权利要求1所述的CAR，其中该CAR从N
‑
末端到C
‑
末端包含：TAA scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ、TAA scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑
CD28
‑
CD3ζ、TAA scFv
‑
CD8铰链
‑
LDLR tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ、或TAA scFv
‑
CD8铰链
‑
SEZ6L2 tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ；其中优选地，该TAA scFv选自CEA scFv、密封蛋白18.2scFv和HER2 scFv中的一种或多种；更优选地，CEA scFv为MN14op CEA scFv，或密封蛋白18.2scFv是841密封蛋白18.2scFv；最优选地，MN14op CEA scFv、841密封蛋白18.2scFv、或HER2 scFv包含与分别由SEQ ID NO.5、30或31表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中优选地，该CAR的N
‑
末端进一步含有前导序列和/或HA序列。3.根据权利要求2所述的CAR，其中该CAR从N
‑
末端到C
‑
末端包含：HA
‑
MN14op CEA scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ、HA
‑
MN14op CEA scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、HER2 scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、HER2 scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑
CD28
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、MN14op CEA scFv
‑
CD8铰链
‑
IL2Rβtm jm DT
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、MN14op CEA scFv
‑
CD8铰链
‑
LDLR tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
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P2A
‑
GFP、MN14op CEA scFv
‑
CD8铰链
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SEZ6L2 tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、841密封蛋白18.2scFv
‑
CD8铰链
‑
SEZ6L2 tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP、或HER2 scFv
‑
CD8铰链
‑
SEZ6L2 tm jm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
P2A
‑
GFP，任选地该CAR不包括P2A
‑
GFP和/或HA；
其中优选地，该CAR包含与分别由SEQ ID NO.9、14、15、17、18、19、21、22或24表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，任选地该CAR的氨基酸序列不包括P2A
‑
GFP、前导序列、和/或HA的氨基酸序列。4.一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含：(1)细胞外配体结合结构域，其包含与预定抗原特异性结合的单链可变片段(scFv)；其中优选地，该预定抗原是肿瘤相关抗原(TAA)；更优选地，该TAA选自以下中的一种或多种：CEA、密封蛋白18.2、CGC3、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、CD38、CD19、CD20、CD22、BCMA、CAIX、CD446、CD13、EGFR、EGFRvIII、EpCam、GD2、EphA2、HER1、HER2、ICAM
‑
1、IL13Ra2、间皮素、MUC1、MUC16、NKG2D、PSCA、NY
‑
ESO
‑
1、MART
‑
1、WT1、MAGE
‑
A10、MAGE
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A3、MAGE
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A4、EBV、PD1、PD
‑
L1、CD25、IL
‑
2、和CD3；(2)跨膜结构域，以及(3)包含IL2Rβ降解序列(DT)和至少一个信号传导结构域的细胞质区段；其中优选地，该IL2Rβ降解序列包含与由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；其中优选地，该IL2Rβ降解序列在该细胞质区段的C
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末端处。5.根据权利要求4所述的CAR，其中该CAR从N
‑
末端到C
‑
末端包含：TAA scFv
‑
CD8铰链
‑
CD8 tm
‑4‑
1BB
‑
CD3ζ
‑
IL2RβDT；其中优选地，该CAR的N
‑
末端进一步含有前导序列和/或HA序列；其中优选地，该TAA scFv是CEA scFv；更优选地，该CEA scFv是MN14op CEA scFv；最优选地，MN14op CEAscFv包含与由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；最优选地，该CAR包含与分别由SEQ ID NO.8或16表示的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，任选地该CAR的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：周立，迈克尔，
申请(专利权)人：山东博安生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：