单域抗体及其在癌症治疗中的用途制造技术

本申请涉及完全人源化的抗FGFR4单域抗体(sdAb)及其变体。本发明专利技术还涉及包含所述sdAb的功能化药物纳米载体、核酸、载体、宿主细胞、免疫细胞以及包含其的组合物，及其用于治疗的用途。途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】al.Clin.Cancer Res.18,3780
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3790(2012))。
[0006]FGF19基因的扩增发现于肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和食道癌中(Huang X.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002；99:11369
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11374；Sawey E.T.et al.,Cancer Cell.2011；19:347
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358；Tiong K.H.et al.,Oncotarget.2016；7:57633；Zhang X.et al.,Thorac.Cancer.2017；8:655
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665；Hoover H.et al.,J.Proteome Res.2015；14:3670
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3679)。
[0007]机制研究显示磷酸化的FGFR4募集并磷酸化两个重要的细胞内靶标，磷脂酶γ(PLCγ)和FGFR底物2(FRS2)[4]。然后可通过PLCγ用被活化的蛋白激酶C(PKC)刺激MAPK。同时，活化的FRS2通过募集生长因子受体结合2(GRB2)可触发MAPK和PI3K
‑
AKT通路。AKT和ERK1/2的活性上调使得FGF19/FGFR4信号转导活化后HCC中细胞增殖和生存增强。FGF19
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FGFR4轴还与转移以及生存较差相关(Touat M.et al.,Clin.Cancer Res.2015；21:2684
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2694).<br/>[0008]已将努力集中于开发靶向FGFR4的选择性抑制剂，其显示为抗癌单一治疗或辅助治疗的特别的前景。已经着重开发了靶向FGFR4的三种策略，包括中和抗体、反义寡核苷酸和小分子抑制剂。
[0009]然而，使用非特异性FGFR抑制剂导致的不可避免的靶上毒性和脱靶活性导致若干副作用(Dieci M.V.et al.,Cancer Discov.2013；3:264
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279)。这些缺点最终限制了它们在癌症患者中的应用。
[0010]因此，为提供用于诊断和/或治疗用途的其他产品，高度期望具有特异性结合胞外结构域并阻断FGFR4介导的信号转导的高亲和力FGFR4抗体。
[0011]因此，本专利技术潜在的技术问题之一是提供新的FGFR4抗体及其使用方法，其适于诊断、预防和/或治疗与FGFR4表达相关的疾病。特别地，由于单域抗体骨架具有用于治疗的许多优点，诸如更好地穿透组织，在肾脏中更快地清除，高特异性或降低的免疫原性，因此本公开的目的是提供可用于多种治疗和诊断策略的抗FGFR4的高亲和力单域抗体。
[0012]嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)治疗的过继转移通常是潜在的免疫治疗之一，其在一系列临床试验的显著成功中显示出治疗血液恶性肿瘤的巨大前景。不幸的是，CAR
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T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中的突破仍未在实体瘤中很好地复制(Y.Guo,Y et al.,Chimeric antigen receptor
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modified T cells for solid tumors:challenges and prospects,J Immunol Res,2016；J.Li et al.,Chimeric antigen receptor T cell(CAR
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T)immunotherapy for solid tumors:lessons learned and strategies for moving forward；J Hematol Oncol,11(2018),p.22)。此外，主要用于设计嵌合抗原受体的scFv表现出许多可能对CAR
‑
T的治疗功效产生负面影响的特征。实际上，scFv的显著特征在于表达和稳定性较差，且易于解折叠和聚集。因此，仍需要改进和多样化肿瘤学中的当前治疗工具，使得不仅覆盖患者情况的多样性以及肿瘤的显著可变性。这对于与FGFR4过表达相关的侵袭性肿瘤(诸如横纹肌肉瘤)是特别关键的。
[0013]专利技术简述
[0014]本申请现提供了以纳摩尔和皮摩尔范围内的亲和力特异性结合FGFR4的合成人源化单域抗体。这些sdAb已进一步表明具有阻断FGFR4介导的癌细胞(且特别是RMS细胞)中FGFR4下游MAPK通路活化的能力。专利技术人进一步表明，用所述FGFR4 sdAb功能化的脂质体特
异性结合FGFR4阳性的细胞并内化。这些结果提供了强有力的证据，即根据本公开的靶向FGFR4的纳米载体(且特别是脂质体)制剂代表FGFR4过表达癌细胞的特异性药物递送平台，特征在于其快速和特异性的受体介导的细胞内摄取。最后，专利技术人生产了显示在体外介导针对表达FGFR4的癌细胞的显著抗肿瘤活性的FGFR4
‑
CAR T细胞，因而代表了有前景的靶向治疗选择。
[0015]因此，本公开涉及抗FGFR4的单域抗体(sdAb)，其中所述人源化抗FGFR4 sdAb具有下式FRW1
‑
CDR1
‑
FRW2
‑
CDR2
‑
FRW3
‑
CDR3
‑
FRW4，且其中所述CDR选自：
[0016]‑
SEQ ID NO:1的CDR1；SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，
[0017]‑
SEQ ID NO:4的CDR1；SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，
[0018]‑
SEQ ID NO:7的CDR1；SEQ ID NO:8的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3，
[0019]‑
SEQ ID NO:10的CDR1；SEQ ID NO:11的CDR2和SEQ ID NO:12的CDR3，
[0020]在一些实施方案中，框架区由以下组成：选自SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17的FRW1，选自SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的FRW2，选自SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19的FRW3，选自SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的FRW4，或其功能性变体，其中在FRW1、FRW2、FRW3和FRW4的每一个中具有不超过0、1、2或3个保守氨基酸取。在更具体的实施方案中，框架区由以下组成：SEQ ID NO:13的FRW1、SED ID NO:14的FRW2、SEQ ID NO:15的FRW3和SEQ ID NO:16的FRW4，或者SEQ ID NO:17的FRW1、SED ID NO:18的FRW2、SEQ ID NO:19的FRW3和SEQ ID NO:20的FRW4，或其功能性变体，其中在FRW1、FRW2、FRW3和FRW4的每一个中具有不超过0、1、2或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.抗FGFR4的人源化合成单域抗体(sdAb)，其中所述抗FGFR4 sdAB具有下式：FRW1
‑
CDR1
‑
FRW2
‑
CDR2
‑
FRW3
‑
CDR3
‑
FRW4，且其中所述CDR选自：
‑
SEQ ID NO:1的CDR1；SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，
‑
SEQ ID NO:4的CDR1；SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，
‑
SEQ ID NO:7的CDR1；SEQ ID NO:8的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3，
‑
SEQ ID NO:10的CDR1；SEQ ID NO:11的CDR2和SEQ ID NO:12的CDR3。2.根据权利要求1所述的人源化抗FGFR4 sdAb，其中所述框架区由以下组成：
‑
选自SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:17的FRW1，
‑
选自SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:18的FRW2，
‑
选自SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19的FRW3，
‑
选自SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的FRW4，或其功能性变体，其中在FRW1、FRW2、FRW3和FRW4的每一个中具有不超过0、1、2或3个保守氨基酸取代。3.根据权利要求2所述的人源化抗FGFR4 sdAb，其具有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中任一个所示的序列。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的人源化抗FGFR4 sdAb，其与选自核酸、多肽或蛋白质、病毒、毒素和化学实体的目标化合物直接或间接、共价或非共价地连接。5.根据权利要求4所述的人源化抗FGFR4 sdAb，其中所述抗体与选自酶、荧光团、NMR或MRI造影剂、放射性同位素和纳米颗粒的诊断化合物直接或间接、共价或非共价地连接。6.根据权利要求4所述的人源化抗FGFR4 sdAb，其中所述抗体与选自细胞毒性试剂、化疗剂、放射性同位素、靶向抗癌剂、免疫治疗剂(诸如免疫抑制剂或免疫刺激剂)和裂解肽的治疗化合物直接或间接、共价或非共价地连接。7.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的FGFR4 sdAB，其直接或间接、共价或非共价地连接至药物纳米载体，任选地有机纳米载体。8.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的FGFR4 sdAB，其中所述有机纳米载体选自聚合物纳米颗粒、脂质体、胶束和基于蛋白质的纳米载体诸如白蛋白，任选地其中所述有机纳米载体是脂质体。9.根据权利要求7或8中任一项所述的FGFR4 sdAB，其中，包封至所述纳米载体中的药物包括治疗化合物或诊断化合物，任选地其中所述治疗化合物是细胞毒性化合物。10.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的FGFR4 sdAb，其与免疫球蛋白结构域融合，任选地，其与Fc结构域融合。11.多特异性结合化合物，其包含至少如权利要求1
‑
10中任一项所定义的FGFR4 sdAb的第一sdAb，且还包含结合第二抗原的另一个sdAb，任选地其中所述第一sdAb位于所述第二sdAb的N端，或其中所述第一sdAb位于所述第二sdAb的C端...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：国家科学研究中心苏黎世大学珩磨生物科学公司，
类型：发明
国别省市：