双特异性蛋白制造技术

本公开提供双特异性蛋白。具体而言，本公开提供一种人GCGR抗体、GLP

【技术实现步骤摘要】
双特异性蛋白
[0001]本申请是申请号为201980071999.X，申请日为2019年12月20日，专利技术名称为“双特异性蛋白”的中国专利申请的分案申请。
[0002]本申请要求2018年12月21日提交的专利申请201811573634.0和2018年12月27日提交的专利申请201811606887.3的优先权；两者通过引用并入本文。


[0003]本公开涉及人GCGR抗体、GLP
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1肽及其突变体，以及GCGR抗体与GLP
‑
1肽融合形成的双特异性蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0004]这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
[0005]糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种表现为胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍，以高血糖为特征的代谢性疾病，其发病主要是胰岛素与胰高血糖素共同作用的结果。
[0006]GLP
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1是影响胰岛素分泌最主要的激素之一，与胰高血糖素(Glucagon)一起均来源于前胰岛素原。前胰岛素原由约158个氨基酸组成，在不同的部位被切割成不同的肽链。人体内具有生物活性的GLP
‑
1主要包括GLP
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1(7
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36)酰胺和GLP
‑
1(7
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37)两种形式。GLP
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1通过小肠L细胞分泌，主要以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛素分泌，保护胰岛β细胞，抑制胰高血糖素分泌来降低机体血糖水平。同时GLP
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1还有抑制胃排空，降低食欲的作用。临床可用于II型糖尿病和肥胖症的治疗。机体内天然活性GLP
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1的半衰期很短(不足2分钟)，很容易被机体内DPPIV酶降解，不具有临床使用价值。
[0007]延长半衰期一直是GLP
‑
1类药物研发的主要方向，目前已有多款GLP
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1激动剂上市，如度拉糖肽(Dulaglutide)和索马鲁肽(Semaglutide)等。虽然GLP
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1在疗效上已经获得人们的充分肯定，但也存在诸多副作用，主要表现为胃肠道症状，低血糖，胰腺炎及肾损伤等。
[0008]胰高血糖素与胰岛素作用相反，主要起升高机体血糖的作用。胰高血糖素是由胰岛α细胞分泌的具有29个氨基酸的肽，与肝细胞膜上受体GCGR结合后主要通过激活下游cAMP/PKA途径，加速糖原分解、脂肪分解和糖异生，使血糖升高。
[0009]研究发现，GCGR基因敲除鼠呈现出GLP
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1升高，肝糖输出减少，脂代谢增加，食欲减退等一系列表型。GCGR是糖尿病治疗最热门的靶点之一，但目前针对GCGR的拮抗类药物研发进展缓慢。REMD Biotherapeutics公司的REMD
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477，目前是最前沿的GCGR单克隆抗体药物，处于临床二期。
[0010]现有技术已在专利CN101589062A、CN101983208A、CN102482350A、CN103314011A、CN105189560A、CN107614695A、US20180273629A1、WO2013059531A1等专利中公开GCGR抗体，但仍有待于提供新的高效的GCGR抗体及糖尿病治疗方法。

技术实现思路

[0011]本公开提供一种抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段具有与人GCGR(或其所包含的抗原表位)结合的能力。
[0012]在一些实施方式中，所述抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含选自如下a)或b)的重链可变区和轻链可变区的组合：
[0013]a)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：48、49和50所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：51、52和53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
[0014]b)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：38、39和54所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：55、56和57所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
[0015]在一些实施方式中，所述抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，包含选自如下i)至vi)的重链可变区和轻链可变区的任一组合：
[0016]i)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；
[0017]ii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；
[0018]iii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、27和28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、30和31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；
[0019]iv)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：32、33和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、36和37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；
[0020]v)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：38、39和40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：41、42和43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
[0021]vi)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：38、39和44所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：45、46和47所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
[0022]在一些实施方式中，所述抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。
[0023]在一些实施方式中，所述抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体包含源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区上具有至多10个回复突变，和/或，所述框架区变体在人抗体的重链框架区基础上具有至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、至多1个氨基酸的回复突变。
[0024]在一些实施方式中，所述框架区变体包含选自：
[0025]aa)轻链可变区中包含42G、44V、71Y和87F中的一个或多个氨基酸回复突变，和/或重链可变区中包含38K、48I、67A、69F、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下所示的重链可变区和轻链可变区的组合：重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。2.根据权利要求1所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其是鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、或人源化抗体或其抗原结合片段。3.根据权利要求2所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体包含源自人抗体的框架区或其框架区变体，其中：所述框架区变体在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个氨基酸的回复突变。4.根据权利要求2所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下所示的轻链可变区和重链可变区组合：重链可变区，其序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO：4所示具有至少90％序列同一性；和轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：5所示或与SEQ ID NO：5所示具有至少90％序列同一性。5.根据权利要求1至4任一项所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全长抗体，进一步包括抗体恒定区，优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体，更优选包含SEQ ID NO：72所示的人抗体重链恒定区和SEQ ID NO：73所示的人抗体轻链恒定区。6.根据权利要求5所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括选自如下所示的重链和轻链的组合：所述重链为SEQ ID NO：80所示或与其具有至少85％序列同一性，且所述轻链为SEQ ID NO：81所示或与其具有至少85％序列同一性。7.一种抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中包含选自如下所示的重链可变区和轻链可变区组合：重链可变区，其包含与SEQ ID NO：4所示重链可变区具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，和轻链可变区，其包含与SEQ ID NO：5所示轻链可变区具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。8.根据权利要求1至7任一项所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。9.一种双特异性蛋白，其包含GLP
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1肽和抗GCGR抗体或其抗原结合片段，所述GLP
‑
1肽通过肽键或接头共价连接至所述的抗GCGR抗体或其抗原结合片段。10.根据权利要求9所述的双特异性蛋白，其中：所述GLP
‑
1肽的羧基端通过肽键或接头连接至所述抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合
片段的重链可变区的氨基端；或者所述GLP
‑
1肽的羧基端通过肽键或接头连接至所述抗GCGR抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基端。11.根据权利要求10所述的双特异性蛋白，其中所述的抗GCGR抗体或其抗原结合片段是权利要求1至8任一项所述的抗GCGR的单克隆抗体或其抗原结合片段。12.根据权利要求9至11任一项所述的双特异性蛋白，其中：所述GLP
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1肽是SEQ ID NO：91所示的GLP
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1肽或其变体，所述GLP
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1肽变体为SEQ ID NO：91所示GLP
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1肽中包含Q17E、I23V、K28R和G30R中一个或更多个氨基酸突变，优选地，所述GLP
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1肽变体包含Q17E突变、或包含Q17E和I23V突变。13.根据权利要求12所述的双特异性蛋白，其中所述GLP
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1肽变体的序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卓晓，罗肖，何宁，胡齐悦，张连山，陶维康，
申请(专利权)人：上海恒瑞医药有限公司，
类型：发明
国别省市：