一株可以耐受低pH生产L-乳酸的乳酸菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株可以耐受低pH生产L

【技术实现步骤摘要】
一株可以耐受低pH生产L
‑
乳酸的乳酸菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一株能够耐受低pH生产L
‑
乳酸的乳酸菌，属于微生物发酵


技术介绍

[0002]乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸而不能分解蛋白质的细菌的统称，通常是不运动、不产芽孢的革兰氏阳性菌，可在厌氧、兼性厌氧条件下生长。乳酸菌在自然界的分布广泛，不仅存在于人和动物的消化道内，在工业、农业等领域也有很高的应用价值。在多数为同型乳酸发酵类型的乳酸菌细胞内，乳酸是糖酵解途径的最终产物，乳酸菌能够利用这一代谢途径获得需要的能量。
[0003]聚乳酸（polylactic acid，PLA）是一种由乳酸单体缩聚而成的可生物降解的高分子聚合物，主要是以微生物的发酵产物乳酸作为单体通过聚合反应而获得。作为聚乳酸，主要包括聚L
‑
乳酸（PLLA）、聚D
‑
乳酸（PDLA）和聚DL
‑
乳酸（PDLLA）三种，其中使用规模最广泛的是PLLA。更具体来说，以光学纯度大于98%的L
‑
乳酸为原料聚合而成的聚乳酸材料在食品、医药、农药、化工等方面都有广泛应用。
[0004]目前，L
‑
乳酸可以通过化学合成法和微生物发酵方法获得。化学合成法具有污染坏境、成本昂贵、技术复杂、光学纯度较低等棘手问题，不能满足实际应用需要。相比之下，微生物发酵法的生产成本低，条件温和和产物光学纯度高等优点，因此绝大部分都是通过微生物发酵法进行L<br/>‑
乳酸的工业生产的。目前L
‑
乳酸发酵菌不能耐受低pH，对培养环境胁迫的抵抗能力低，发酵生产过程需要加入氧化钙中和至pH6.0才能让发酵顺利进行，但随后会产生大量的硫酸钙废弃物，给环境带来了巨大的污染。
[0005]就此而言，在乳酸发酵工业中，显著提高菌株耐低pH的能力，生产并积累更多的L
‑
乳酸，使其更适合应用于工业生产，具有积极的研究意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一株能够耐低pH生产L
‑
乳酸的乳酸菌菌株，该菌株能够显著提高原有菌株对于低pH坏境的耐性，生产的L
‑
乳酸光学纯度大，且生产过程对环境污染小。
[0007]一株耐低pH乳酸菌株，其分类命名为保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus) QSE
‑
1993，已于2019年2月18日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为中国 武汉 武汉大学，保藏编号： CCTCC NO:M 2019095。
[0008]本专利技术所述菌株保加利亚乳酸杆菌QSE
‑
1993是将从四川采集到的原始菌株QSE
‑
1经过诱变得到，将菌株QSE
‑
1使用平板划线的方式接入MRS培养基中活化二代，37℃条件下培养至OD=1，使用无菌水稀释到OD=0.6后，涂布于菌后的平板上，在无菌条件下吹干显微观察无细胞重叠后进行离子束注入，选择氮离子束，注入条件为10
‑
30KeV，注入剂量为15x10
13
～35x10
13 ions/cm3，处理时间为120s。注入结束后，取出平板使用无菌水洗脱。涂布于MRS平板，在厌氧环境内培养活化。培养一段时间后，将菌种接入调节过pH的MRS固体培养基中培养72h，多次重复这一过程，观察并筛选出生长状况良好的菌株。将上一步筛选得到的菌
株制成细胞悬液，将浓度调整为10
‑6/ml。取0.1ml细胞悬液涂布于灭菌后的平板上，吹干后进行氮离子束注入，条件为20～30KeV，注入剂量为15x10
14
～35x10
14
ions/cm3，注入时间120s。注入完毕后，用无菌水洗脱平皿，洗脱后的菌液涂布到固体MRS培养基上，37℃ 条件下倒置培养24h。
[0009]将诱变得到的菌种接种至种子培养基中，37 ℃培养10～16h，摇瓶装液量为10%～30%（v/v）。将种子培养基中的菌液接种至MRS液体培养基，与厌氧袋一起装入厌氧罐内培养48h。将菌种接种至调节过pH的固体培养基中，挑选生长情况良好的菌株。重复复筛步骤，直到筛选出目标菌株。
[0010]筛选得到的具有耐低pH能力的乳酸菌命名为保加利亚乳酸杆菌QSE
‑
1993，在MRS琼脂培养基中生长良好，观察到的菌株形态为圆形或稍不规则形状，菌落形态为灰白色、不透明，表面光滑，稍微隆起，边缘粗糙明显；为革兰氏阳性杆菌，无孢子生成。
[0011]本专利技术中能够耐低pH的乳酸菌为兼性厌氧菌，适宜生长温度为35
‑
45℃，更适宜的生长温度范围为30
‑
37℃。能够在低pH条件下正常生长，可耐pH值最低可以达到2
‑
3，有效提升乳酸菌抵抗外界不良环境的能力。
[0012]所述保加利亚乳酸杆菌QSE
‑
1993的培养方法为：1）平板培养：将保加利亚乳酸杆菌QSE
‑
1993接种至平板培养基上培养，培养温度为35~45℃，培养时间为36~48h；2）斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的乳酸菌接种至斜面培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间为36~48h；3）种子培养：将步骤2）中乳酸菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间10~20h；4）发酵培养：将步骤3)中种子培养的乳酸菌接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，发酵温度35~37℃，发酵时间24
‑
120h。
[0013]所述平板培养基包含如下质量的组分：蛋白胨 10g/L、酵母提取物 10g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温801mL/L。
[0014]所述发酵温度为35
‑
37 ℃，发酵时间为36
‑
70小时。
[0015]所述斜面培养基: 琼脂2%、蛋白胨 10g/L、酵母提取物 10g/L、乙酸钠 5g/L、磷酸氢二钾 2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、柠檬酸二铵 2 g/L、玉米浆 20 g/L、硫酸铵 5 g/L、硫酸锰 0.25 g/L、吐温801mL/L。
[0016]所述发酵温度为35
‑
37 ℃，发酵时间为36
‑
48小时。
[0017]所述种子培养基: 蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、乙酸钠0.5g/L、柠檬酸二铵0.2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸铁0.01g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、玉米浆50g/L。
[0018]所述发酵温度为35
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐低pH乳酸菌株，其分类命名为保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusbulgaricus)QSE
‑
1993，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO:M2019095。2.根据权利要求1所述的耐低pH乳酸菌株，其特征在于，所述菌株能够在低pH条件下正常生长，可耐pH值最低可以达到2
‑
3。3.权利要求1所述耐低pH乳酸菌株在发酵生产L
‑
乳酸中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在营养培养基中培养保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusbulgaricus)QSE
‑
1993，发酵生产L
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞龙，秦倩，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：