原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法技术

本申请涉及原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：S1.将原核蛋白表达用菌于培养基中培养至OD

【技术实现步骤摘要】
原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法


[0001]本申请属于生物
，具体涉及原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了获得大量的目的蛋白，可以通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到某个宿主细胞，使其大量表达。蛋白表达使用最多的是原核蛋白表达系统，其中大肠杆菌是基因工程中采用最多的原核表达宿主，那么在进行大肠杆菌蛋白表达转化时，需要用到大肠杆菌表达感受态细胞进行转化诱导。
[0003]感受态细胞的定义为：利用理化方法诱导宿主细胞(一般为大肠杆菌细胞)，能吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态叫做感受态细胞。感受态细胞在基因工程中扮演着很重要的角色。根据实验目的需要选择一款合适的感受态细胞。大肠杆菌BL21(DE3)菌株是原核蛋白表达实验中比较重要的宿主菌，它能满足大部分的蛋白表达实验，主要是非毒性蛋白的表达，在整个基因工程中运用的比较多。
[0004]目前，制备感受态细胞的方法主要分为两大类即化学方法和物理方法，化学方法就是用各种化学试剂来处理细胞；而物理方法一般包括电转化法以及超声波转化法。大多数分子实验室用的最多的也就是化学法制备的感受态，因为它制备简单，所需仪器设备都是分子试验常规仪器。最常用的化学方法是Mendel和Higa专利技术的用CaCl2法来制备的感受态细胞，该方法的优点是CaCl2法可以广泛的应用到不同类型的感受态细胞的制备。但是缺点是效价比较低，要现配现用，保存时间比较短，不能满足大部分用户的需求。还有许多后续在CaCl2法基础上开发出来的化学方法如RbCl法、Inoue法、TSS一步法、甘油
‑
聚乙二醇法等，这些方法制备出来的感受态相较于CaCl2法转化能力有所提升，能满足普通试验转化，但是对于有特殊需求的试验，如需转化效率高的试验，蛋白需求量大，复杂的蛋白表达试验，普通的制备方法就不能满足相应的试验需求。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要一种原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法，该方法制备的感受态细胞转化率高、稳定性好。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]本申请第一方面提供了一种原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1.将原核蛋白表达用菌于培养基中培养至OD
600
为0.4～0.5；
[0009]S2.将菌液冰浴；离心，获得沉淀；
[0010]S3.向沉淀中加入缓冲液进行悬浮，冰浴，离心，获得沉淀；
[0011]S4.向沉淀中加入缓冲液进行悬浮，冰浴，加入添加剂，冰浴，获得感受态细胞；
[0012]其中，所述缓冲液包括氯化钙、氯化锰、氯化镁、醋酸钾和甘油，所述添加剂为PIPES。
[0013]在其中一些实施例中，所述缓冲液包括0.1M～0.5M氯化钙、0.1M～0.5M氯化锰、0.1M～0.2M氯化镁、1.0M～2.0M醋酸钾和甘油2.0M～3.0M。
[0014]在其中一些实施例中，所述添加剂为0.2M～0.5M PIPES。
[0015]在其中一些实施例中，所述冰浴时间为10min～30min。
[0016]在其中一些实施例中，所述步骤S3中加入缓冲液的体积为按每500ml菌液加入100ml～300ml缓冲液。
[0017]在其中一些实施例中，所述步骤S4中加入缓冲液的体积为按每500ml菌液加入10ml～30ml缓冲液。
[0018]在其中一些实施例中，所述步骤S4中加入添加剂的体积与所述步骤S4中加入缓冲液的体积比为1:(1～4)。
[0019]在其中一些实施例中，所述制备方法还包括将获得的所述感受态细胞分装，放入液氮速冻2
‑
3min后，放入
‑
80℃超低温冰箱储存。
[0020]本申请第二方面提供了所述的制备方法制备获得的感受态细胞。
[0021]本申请第三方面提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液，所述缓冲液包括0.1M～0.5M氯化钙、0.1M～0.5M氯化锰、0.1M～0.2M氯化镁、1.0M～2.0M醋酸钾和甘油2.0M～3.0M。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本申请提供的一种原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法，该方法操作简单，操作工艺上更加规范标准，在制备过程中使用特定的缓冲液及添加剂提高感受态细胞的转化率，且感受态细胞储存时间长，稳定性好。
附图说明
[0024]图1为实施例2中制备方法的效价检测转化示意图。
具体实施方式
[0025]为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
[0026]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
[0027]本文所使用的术语“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
[0028]本文所使用的术语“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本专利技术保护范围的限制。
[0029]本文所使用的术语“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、等中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为
隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
[0030]目前标准pUC19质粒转化BL21(DE3)感受态的转化效率低且针对不同用户设计的表达质粒转化长菌数量少来提高BL21(DE3)感受态的效价及其稳定性，在实际使用BL21(DE3)感受态细胞时会因为实验习惯，试验需求等导致效价有所差异，不能满足用户需求。
[0031]因此，本申请一实施方式提供了一种原核蛋白表达用菌感受态细胞制备的方法，主要从原始菌如何筛选高活性菌株，感受态制备过程使用独特的缓冲液和添加剂来实现高效原核表达用菌感受态的制备。该方法感受态细胞稳定性好，能在超低温冰箱中存放至少7个月时间。批间重复性好，标准pUC19质粒转化能达到>109水平。另外本申请制备感受态的流程标准，可应用于其他任何感受态的制备。具体地，包括步骤S1～步骤S4：
[0032]步骤S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原核蛋白表达用菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将原核蛋白表达用菌于培养基中培养至OD
600
为0.4～0.5；S2.将菌液冰浴；离心，获得沉淀；S3.向沉淀中加入缓冲液进行悬浮，冰浴，离心，获得沉淀；S4.向沉淀中加入缓冲液进行悬浮，冰浴，加入添加剂，冰浴，获得感受态细胞；其中，所述缓冲液包括氯化钙、氯化锰、氯化镁、醋酸钾和甘油，所述添加剂为PIPES。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液包括0.1M～0.5M氯化钙、0.1M～0.5M氯化锰、0.1M～0.2M氯化镁、1.0M～2.0M醋酸钾和2.0M～3.0M甘油。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述添加剂为0.2M～0.5M PIPES。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述冰浴时间为10min～30min。5.根据权利要求1～3任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜军，王媛媛，曹文刚，宋辉，
申请(专利权)人：湖北擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：