血清中脂溶性维生素的检测方法技术

本发明专利技术涉及营养物质检测技术领域，具体涉及血清中脂溶性维生素的检测方法。本发明专利技术提供一种测定血清中脂溶性维生素的检测方法，此方法操作简单，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得较纯的含有待测物的处理液，此处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，一次样本处理可同时完成多种维生素的定量和定性分析，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度，具有较好的利用价值。较好的利用价值。

【技术实现步骤摘要】
血清中脂溶性维生素的检测方法


[0001]本专利技术涉及营养物质检测
，具体涉及血清中脂溶性维生素的检测方法。

技术介绍

[0002]脂溶性维生素包含维生素A、D、E、K，是维持正常的生理功能而必需从食物中获得的一类有机物质，在人体生长和代谢过程中发挥着极其重要的作用。
[0003]维生素A(视黄醇)是维持人体正常视觉功能不可缺少的营养素，此外，其在血清中的表达与人体免疫系统的功能存在密切联系。在机体维生素A缺乏的状态下，很容易出现抵抗能力减弱的情况，从而导致呼吸道等易感系统出现感染性疾病。有研究表明，在儿童群体中，由于其自身的生理解剖特点及某些不良生活习惯，VA缺乏与支气管炎、扁桃体炎等呼吸道疾病的发生有密切关联，因此对其呼吸系统感染预防以及治疗中，需要在日常膳食中注意维生素A的添加补充。VA过量则会导致一些中毒症状。
[0004]维生素D主要调节人体内钙、磷代谢，维持血浆钙、磷水平，从而维持骨骼的正常生长和发育。除了对钙吸收的作用以外，对于自身免疫疾病也具有重要作用，包括多发性硬化症、Ⅰ型糖尿病以及类风湿性关节炎。定期检测维生素D水平并进行有针对性的补充，对感染性疾病的控制与预防具有重要意义。维生素D主要有两种活性成分组成：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。其在人体内的代谢路径为：在肝脏中代谢为25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3，然后经由肾脏转化为1,25
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二羟基维生素D2和1,25
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二羟基维生素D3，其中25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3是反映体内维生素D水平的主要循环形式，目前为国际上公认的衡量维生素D的最佳指标。
[0005]维生素E(VE)又名生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，具有抗炎、维持正常免疫功能和抑制细胞增殖等生理作用，能促进性激素的分泌，尤其是生育过程中一个必不可少的营养成分。妊娠期妇女营养需求高，身体代谢快，可产生大量自由基，若体内VE含量过低，无法捕获过多的自由基造成自由基过量，会引发胎盘老化、胎膜早破，发生妊娠期高血压、糖尿病等疾病。
[0006]维生素K1参与人体内凝血因子的合成，对正常的血液凝结有重要作用，人体内维生素K1缺乏可造成凝血障碍，导致凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症等。而维生素K1补充过量可导致严重的不良反应，包括呼吸困难、紫绀、过敏性休克等。
[0007]目前市面上检测维生素D主要采用酶联免疫法和化学发光法，检测维生素A、E主要采用液相色谱法。目前也有液相与质谱联用的检测方式出现。授权号为CN 106442754 B的专利公开了一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，将血清样本进行液液萃取后进行液相色谱或液相色谱串联质谱检测。其标准曲线的做法：90μL混合标准工作液加10μL内标混匀，取80μL直接进样。样本的前处理过程：首先将全血样本离心，取上清得血清，然后加入纯水或甲酸水稀释后加入沉淀剂涡旋离心去蛋白，再加入正己烷萃取，取上清液氮吹，加复溶液上机检测。使用的检测仪器为液相色谱(荧光检测器)或液相色谱串联质谱。此方法虽然能进一步净化样本，但样本纯化不彻底，样本中的杂质含量较高，不利于实现临床
样本中维生素含量的自动化检测。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供血清中脂溶性维生素的检测方法。
[0009]本专利技术提供了血清中脂溶性维生素的检测方法，其包括对待测血清样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；
[0010]本专利技术中，所述待测全血样品前处理包括：将待测样品与内标溶液混匀后依次加入沉淀剂、磁珠溶液，磁分离后取上清进行液相色谱串联质谱检测定量分析；
[0011]所述内标溶液的溶剂为甲醇，所述内标溶液包括：490～510μg/mL维生素A
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D6、90～110μg/mL 25
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羟基维生素D2
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D3、90～110μg/mL 25
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羟基维生素D3
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D3、490～510μg/mL维生素E
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D6和990～1010ng/mL维生素K1
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D7；
[0012]所述沉淀剂为乙腈，实验结果表明，沉淀剂中甲醇比例越高，沉淀越不紧密，磁吸过后的溶液澄清度越低；以乙腈为沉淀剂磁吸后的溶液澄清，杂质去除效果好。
[0013]所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。
[0014]进一步的，在本专利技术中，
[0015]所述内标溶液为：500μg/mL维生素A
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D6、100μg/mL 25
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羟基维生素D2
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D3、100μg/mL 25
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羟基维生素D3
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D3、500μg/mL维生素E
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D6和1000ng/mL维生素K1
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D7；
[0016]所述磁珠溶液中的甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠；所述的羟基官能团包括1
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18烷基、辛基、苯基、环己基等类型官能团。
[0017]所述待测血清样品、内标溶液、沉淀剂与磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。
[0018]本专利技术所述的检测方法中，所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3；
[0019]本专利技术所述的检测方法中，所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：
[0020]流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；
[0021]流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；
[0022]洗脱程序为：
[0023]第0～1.80min，流动相A的体积分数为20％至5％；
[0024]第1.80～2.60min，流动相A的体积分数由5％至0％；
[0025]第2.60～3.60min，流动相A的体积分数为0％；
[0026]第3.60～3.61min，流动相A的体积分数由0％至20％；
[0027]第3.61～4.0min，流动相A的体积分数为20％；
[0028]第4.00～4.50min，流动相A的体积分数为20％。
[0029]进一步的，所述液相色谱串联质谱的色谱条件还包括：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1
×
50mm)，柱温：45℃，进样量20μL，进样温度：8℃，流速：0.5mL/min；
[0030]本专利技术中，所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血清中脂溶性维生素的检测方法，其包括对待测血清样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；所述待测血清样品前处理包括：将待测血清样品与内标溶液混匀后依次加入沉淀剂、磁珠溶液，磁分离后取上清；所述内标溶液的溶剂为甲醇，所述内标溶液包括：490～510μg/mL维生素A
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D6、90～110μg/mL 25
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羟基维生素D2
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D3、90～110μg/mL 25
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羟基维生素D3
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D3、490～510μg/mL维生素E
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D6和990～1010ng/mL维生素K1
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D7；所述沉淀剂为乙腈；所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～6mg/mL。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内标溶液为：500μg/mL维生素A
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D6、100μg/mL 25
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羟基维生素D2
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D3、100μg/mL 25
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羟基维生素D3
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D3、500μg/mL维生素E
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D6和1000ng/mL维生素K1
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D7；所述磁珠溶液中，甲醇的体积分数为20％，磁珠的浓度为2mg/mL；所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测血清样品、内标溶液、沉淀剂和磁珠溶液的体积比为10：1：40：10。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K；所述维生素D包括25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3；所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；流动相B为甲酸甲醇溶液，其中甲酸的体积分数为0.1％；洗脱程序为：第0～1.80min，流动相A的体积分数为20％至5％；第1.80～2.60min，流动相A的体积分数由5％至0％；第2.60～3.60min，流动相A的体积分数为0％；第3.60～3.61min，流动相A的体积分数由0％至20％；第3.61～4.0min，流动相A的体积分数为20％；第4.00～4.50min，流动相A的体积分数为20％。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的色谱条件还包括：色谱柱：Kinetex C18(2.6μm，2.1
×
50mm)，柱温：45℃，进样量20μL，进样温度：8℃，流速：0.5mL/min。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描；所述正离子MRM扫描具体参数为：离子化电压5500(V)、温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7psi、喷雾气50psi、辅助加热气50psi。7.检测血清中脂溶性维生素的试剂盒，其包括质控品、校准品、内标溶液、稀释液、沉淀剂、磁珠溶液、流动相A和流动相B；所述质控品包括低值质控品和高值质控品；
所述低值质控品为：0.4134～0.6202μg/mL维生素A、0.012518～0.018778μg/mL 25
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羟基维生素D2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高培丽，蔡克亚，刘亚娟，孙江彦，李宾宾，申业明，杨雪莹，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：