基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，本发明专利技术涉及一种基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的组合物及其应用。本发明专利技术提供一种基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂组合，包括第一组合物。使用本发明专利技术的试剂组合，能够以1拷贝/μL的灵敏度检测猴痘病毒，同时，结合一步法核酸释放剂，无需核酸纯化步骤，检测周期短，操作步骤少，特异性好。特异性好。特异性好。

【技术实现步骤摘要】
基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的组合物及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，本专利技术涉及一种基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的组合物及其应用。

技术介绍

[0002]猴痘(monkeypox)亦称猴天花，并已被定为人畜共患病。以猴痘病毒为病原，发源于中、西非的热带雨林地区。猴痘病毒是一种基因组长达200Kb左右的DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为回角砖形或卵圆形，大小为200
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400nm，外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链DNA基因组。猴痘病毒的基因组为双链DNA，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列。该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中；同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等。猴痘是一种罕见的病毒性人畜共患病(从动物传播给人的病毒)，病人症状与过去在天花病人身上所观察到的相似，但临床严重程度较轻。随着在1980年消灭了天花和随后停止接种天花疫苗，猴痘成为最严重的正痘病毒。
[0003]环介导等温扩增(LAMP)是目前恒温扩增中应用最广的一种，由Notomi团队于2000年首次提出，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的4
‑
6个区域设计2
‑
3对特异性引物，包括必须的两对引物(1对外引物、1对内引物)和一对可选的环状引物，在一定恒定温度下，3种特异引物依靠链置换Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
[0004]随着检测需求的提高，POCT(point
‑
of
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care testing，即时检验)的应用使得环介导等温扩增(LAMP)成为目前分子诊断热门，由于其检测时间短、检测效率高且扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目，已成为目前分子诊断行业新趋势。
[0005]而核酸检测通常需要将核酸从样本中提取出来，其过程复杂，耗时长，而通常一些免提取的试剂又会对扩增造成影响。
[0006]因此，本领域需要一种LAMP扩增体系，其灵敏度高，特异性好，同时又能采用免提取的方法对样本进行扩增，并不会对扩增带来影响。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供一种基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂组合，包括第一组合物：
[0008]MPV
‑
F3：ATCCATTGTCGTAGACCAA(SEQ ID NO:1)
[0009]MPV
‑
B3：AGTTGCGTTAGTTCTCTCT(SEQ ID NO:2)
[0010]MPV
‑
FIP：GGAGAAGCGAGAAGTTAATAAAGCT
[0011]‑
CGTTGGAGCTGTAAACCA(SEQ ID NO:3)
[0012]MPV
‑
BIP：GTACAGCAGTAGCTCCTTAGTCC
[0013]‑
GATCTATATTGACGAGCGTTC(SEQ ID NO:4)
[0014]MPV
‑
LF：CTGTATGATCTTCAACGTAGTGCTA(SEQ ID NO:5)
[0015]MPV
‑
LB：TTAATAACCGCACACAATCTCTGTG(SEQ ID NO:6)。
[0016]进一步地，所述试剂组合还包括第二组合物，其中，所述第二组合物包括细胞保存液。
[0017]使用本专利技术的试剂组合，能够以1拷贝/μL的灵敏度检测猴痘病毒，同时，结合一步法核酸释放剂，无需核酸纯化步骤，检测周期短，操作步骤少，特异性好。
[0018]本专利技术中提及的“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术(Extraction Free Nucleic Acid Release and Amplification Technology,EFNART)。其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配碱性质下的细胞保存液和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。
[0019]在一些具体的实施方案中，第二组合物包括：
[0020]灭活的细胞保存液，其包括有：Tris HCl的终浓度为20～150mM；Triton
–
100终浓度为0.05～2％(v/v)；吐温20终浓度为0.01～0.2％(v/v)；NaCl的终浓度为10～100mM；氯化铵终浓度为10～100mM；氯化锂终浓度为20～200mM；焦磷酸钠终浓度为50～100mM；二硫苏糖醇终浓度为0.01～1％(w/v)；Proclin
–
300终浓度为0.01％；所述细胞保存液pH值8～9。
[0021]在一个具体的实施方案中，本专利技术的试剂组合的各组合物分别存在于单独包装中。
[0022]在一个具体的实施方案中，本专利技术的试剂组合的各组合物存在于同一个包装中。
[0023]进一步地，本专利技术的试剂组合的各组合物中的各成分以混合的形式存在。
[0024]第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的试剂组合在制备检测猴痘病毒的试剂盒中的用途。
[0025]进一步地，本专利技术提供了上述本专利技术的试剂组合在制备一步法检测猴痘病毒的试剂盒中的用途。
[0026]第三方面，本专利技术提供了一种一步法检测猴痘病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本专利技术的试剂组合。
[0027]进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
[0028]在一些具体的实施方案中，阴性质控品是灭活的细胞保存液和DEPC水，阳性质控品是人工合成的猴痘质粒。
[0029]进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、dUTP、LAMP缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0030]更进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、dUTP、Bst酶、尿嘧啶
‑
N
‑
糖基化酶(UNG酶)、LAMP缓冲液、荧光核酸染料SYTO
‑
9、以及Mg
2+
中的至少一种。
[0031]常见的LAMP缓冲液由Tris
‑
HCl、(NH4)2SO4、KCl、Tween
‑
20、SDS、甜菜碱、DMSO等缓冲体系构成。一般单个LAMP反应管中总体积为20～100μl。
[0032]具体地，LAMP缓冲液包括100
‑
500mM Tris
‑
HCl，优选的300mM；20
‑
200mM(NH4)2SO4，优选的100mM；50...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环介导等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂组合，其特征在于，包括第一组合物：MPV
‑
F3：ATCCATTGTCGTAGACCAA(SEQ ID NO:1)MPV
‑
B3：AGTTGCGTTAGTTCTCTCT(SEQ ID NO:2)MPV
‑
FIP：GGAGAAGCGAGAAGTTAATAAAGCT
‑
CGTTGGAGCTGTAAACCA(SEQ ID NO:3)MPV
‑
BIP：GTACAGCAGTAGCTCCTTAGTCC
‑
GATCTATATTGACGAGCGTTC(SEQ ID NO:4)MPV
‑
LF：CTGTATGATCTTCAACGTAGTGCTA(SEQ ID NO:5)MPV
‑
LB：TTAATAACCGCACACAATCTCTGTG(SEQ ID NO:6)。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包括第二组合物，其中，所述第二组合物包括细胞保存液。3.根据权利要求2所述的试剂组合，其特征在于，所述细胞保存液包括：Tris HCl的终浓度为20～150mM；Triton
–
100体积/体积比终浓度为0.05～2％；吐温20体积/体积终浓度为0.01～0.2％；NaCl的终浓度为10～100mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：王频艺，纪博知，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：