一种用于检测EGFR-ctDNA电化学生物传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种用于检测EGFR

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测EGFR
‑
ctDNA电化学生物传感器及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及电化学生物传感器
，尤其涉及一种用于检测EGFR
‑
ctDNA电化学生物传感器及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]肺癌因其恶性程度高和缺乏有效的治疗手段已经成为全球癌症致死的主要原因。根据世界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)的调查显示，2020年全球发生了1930万新癌症病例和近1000万癌症死亡病例，其中肺癌的死亡病例约180万，居第一位。肺癌因其起病隐匿，绝大部分肺癌患者首次就诊时已经处于肺癌晚期，患者的整体生存情况不容乐观。
[0003]肺癌分为小细胞癌和非小细胞肺癌，其中大约80～85％为非小细胞肺癌，恶性程度高，预后效果极差。研究表明，核酸与癌症的发生密切相关，大量癌组织中存在特定DNA碱基序列的突变或者microRNA基因的异常表达。它们是由自身因素和外界环境共同作用而导致的，但是归根结底，几乎所有的癌症都是由基因突变引起的。另一方面，随着研究的深入，不仅发现更多的疾病与基因有关，而且其中一些疾病可以通过基因治疗而被治愈。因此，疾病的早期检测至关重要。对于大多数疾病来说，早发现早治疗能更好的挽救患者的生命。循环肿瘤基因(circulating tumor DNA，ctDNA)是一种重要的液体活检肿瘤标志物，由单链或双链DNA以及单链与双链DNA复合物组成，是肿瘤细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入人体血液循环系统的胞外DNA。
[0004]表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)与调节细胞增殖、存活、生长和分化有关，但是如果EGFR的过度表达，将直接与人类癌症相关。以往研究表明，60％以上的非小细胞肺癌患者，其表皮生长因子受体高表达，且存在大量的突变位点。其中，EGFR突变是亚裔非小细胞肺癌患者最常见的基因突变类型，外显子21上L858R位点突变占40％～45％，是非小细胞肺癌中突变频率最高的。另外，部分非小细胞肺癌患者经过9～13月药物治疗后，约60％的患者可能会产生外显子20上EGFR
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T790M位点耐药突变。针对非小细胞肺癌患者EGFR基因检测，有助于在临床治疗上采取更加合理有效的治疗方案。因此，基因检测对疾病的诊断和筛查具有重要意义，开发一些精确、快速、低成本的分析方法用于检测人体内微量核酸，对于人类重大疾病的早期诊断与预后具有重要的意义。
[0005]电化学生物传感器是电化学和分子生物学相结合的一种分析手段，已广泛地应用于食品药品检验、环境检测、临床分析等领域，现有技术中利用电化学生物传感器对EGFR
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ctDNA进行检测存在稳定性差、线性范围窄、灵敏度低的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本申请提供一种用于检测EGFR
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ctDNA电化学生物传感器及其制备方法与应用，稳定性好、线性范围宽、灵敏度高。
[0007]为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本申请提供一种用于EGFR
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ctDNA检测的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1.获取干净的玻碳电极并进行羧基化改性，获得羧基化玻碳电极；
[0010]S2.将聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物与壳聚糖溶液滴加于所述羧基化玻碳电极表面，晾干，得到壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极；
[0011]S3.将戊二醛溶液滴加于所述壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极表面，0
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10℃孵育后，用磷酸盐缓冲液冲洗，而后再滴加分子探针发夹DNA溶液，室温孵育后，用磷酸缓冲液冲洗，得到发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极；
[0012]S4.将金铂复合物滴加于所述发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极表面，用PBS缓冲液冲洗后，再滴加牛血清白蛋白溶液，得到牛血清白蛋白/金铂/发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极，即为所述电化学生物传感器；
[0013]所述共价有机框架复合物为三维亚胺类COFs。
[0014]优选地，所述聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物的制备方法如下：
[0015]K1.将三维亚胺类COFs分散于纯水中，并加入HAuCl4的水溶液，搅拌后，加入NaBH4的水溶液，搅拌反应后，离心、洗涤，得到金纳米粒子@共价有机框架复合物；
[0016]K2.在所述金纳米粒子@共价有机框架复合物中加入聚乙烯亚胺的水溶液，进行共价键合反应，离心、洗涤，得到聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物。
[0017]优选地，所述三维亚胺类COFs的制备方法如下：将1,3,5
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三(4
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氨苯基)苯及2,5
‑
二乙烯基对苯二甲醛为原料溶解于乙腈中，加入冰醋酸，室温避光静置，进行脱水缩合反应，即得所述三维亚胺类COFs。
[0018]优选地，所述金铂复合物的制备方法如下：
[0019]L1.在CTAB的水溶液中分别加入HAuCl4与抗坏血酸的水溶液，分散后，加入NaOH溶液，加热条件下静置反应，冷却后洗涤，即得金纳米球溶液；
[0020]L2.将所述金纳米球溶液加入至CTAB水溶液中，分散均匀后，加入氯铂酸钾与抗坏血酸的混合溶液，加热回流，冷却后洗涤，即得所述金铂复合物。
[0021]优选地，所述发夹DNA由36bp组成。
[0022]优选地，所述发夹DNA碱基序列为：
[0023]T790M
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hairpin
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DNA：5'
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NH2‑
(CH2)6‑
GGCTCAAGACATGAGCTGCATGATGAGTCTTGAGCC
‑
(CH2)6‑
SH
‑
3'
[0024]L858R
‑
Hairpin
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DNA：5'
‑
NH2‑
(CH2)6‑
GGCTCAAGACAGTTTGGCCCGCCCAAATCTTGAGCC
‑
(CH2)6‑
SH
‑
3'。
[0025]第二方面，本申请提供一种电化学生物传感器。
[0026]第三方面，本申请提供一种电化学生物传感器在检测EGFR
‑
ctDNA中的应用。
[0027]优选地，包括以下步骤：
[0028]N1.以银/氯化银电极或饱和甘汞电极为参比电本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于EGFR
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ctDNA检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获取干净的玻碳电极并进行羧基化改性，获得羧基化玻碳电极；S2.将聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物与壳聚糖溶液滴加于所述羧基化玻碳电极表面，晾干，得到壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极；S3.将戊二醛溶液滴加于所述壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极表面，0
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10℃孵育后，用磷酸盐缓冲液冲洗，而后再滴加分子探针发夹DNA溶液，室温孵育后，用磷酸缓冲液冲洗，得到发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极；S4.将金铂复合物滴加于所述发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极表面，用PBS缓冲液冲洗后，再滴加牛血清白蛋白溶液，得到牛血清白蛋白/金铂/发夹DNA/戊二醛/壳聚糖/PEI
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AuNPs@COFs的玻碳修饰电极，即为所述电化学生物传感器；所述共价有机框架复合物为三维亚胺类COFs。2.根据权利要求1所述的用于EGFR
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ctDNA检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物的制备方法如下：K1.将三维亚胺类COFs分散于纯水中，并加入HAuCl4的水溶液，搅拌后，加入NaBH4的水溶液，搅拌反应后，离心、洗涤，得到金纳米粒子@共价有机框架复合物；K2.在所述金纳米粒子@共价有机框架复合物中加入聚乙烯亚胺的水溶液，进行共价键合反应，离心、洗涤，得到聚乙烯亚胺包裹的金纳米粒子@共价有机框架复合物。3.根据权利要求2所述的用于EGFR
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ctDNA检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述三维亚胺类COFs的制备方法如下：将1,3,5
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三(4
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氨苯基)苯及2,5
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二乙烯基对苯二甲醛为原料溶解于乙腈中，加入冰醋酸，室温避光静置，进行脱水缩合反应，即得所述三维亚胺类COFs。4.根据权利要求1所述的用于EGFR
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ctDNA检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述金铂复合物的制备方法如下：L1.在CTAB的水溶液中分别加入HAuCl4与抗坏血酸的水溶液，分散后，加入NaOH溶液，加热条件下静置反应，冷却后洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张甜，李明，皮埃尔，张嘉文，赵俊虎，杨帆，史玮玮，胡佳翱，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：