尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒。本发明专利技术提供了一种用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获物和检测物；所述标准抗原为健康人尿调蛋白；所述捕获抗物为抗尿调蛋白的抗体，所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素。与现有的技术方案相比，该检测方法无需收取大量尿标本进行蛋白纯化，可直接使用少量尿液标本直接进行检测，这大大简化了检测流程。该检测方案要求设备及试剂简单易获取，使用该检测方法耗时少，花费低，便于临床开展。Sda抗原表达水平在肾损伤时发生改变，快速便捷的检测方法为临床早期诊断治疗争取了宝贵的时间。贵的时间。

【技术实现步骤摘要】
尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及尿调蛋白Sda抗原糖基化检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]糖基化是蛋白重要的翻译后修饰，糖基化异常可辅助疾病诊断并参与疾病发生发展过程。尿调蛋白是正常人尿液中含量最丰富的蛋白质，它主要表达在肾脏髓袢升支粗段，N
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糖含量丰富(占分子量30％)，在多种肾脏疾病中发挥了重要作用。尿调蛋白水平改变可作为生物标志物辅助肾脏疾病诊断。疾病状态下，尿调蛋白糖基化改变可早于蛋白水平。尿调蛋白N
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糖修饰末端中含有一种特殊的Sda抗原。它的结构组成为GalNAcβ(1,4)[Neu5Acα(2,3)]Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,3)Gal。Sda抗原为尿调蛋白表达的特殊抗原，Sda抗原合成的限速酶β
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1,4N
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乙酰胺基半乳糖基转移酶2在胃肠道细胞和肾脏外髓(由表达尿调蛋白的髓袢升支粗段组成)特异性表达。
[0003]目前用于尿调蛋白糖基化检测的技术手段包括质谱检测，液相色谱检测，凝集素芯片检测和核磁共振检测。其中基质辅助激光解吸电离与飞行时间联用质谱分析技术由于操作简单，且能提供丰富的糖型信息等优点，往往是N
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糖分析的首选。但是，质谱依赖分子量进行N
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糖链预测，而N
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糖链的多样性导致质谱结果的精确性不足。质谱检测需要蛋白样本量较大，耗时较长，不便于临床检测推广。凝集素芯片技术是近年研发的用于糖基化检测的新技术。凝集素是一种可以特异性识别并结合糖的蛋白质。凝集素芯片是一种高通量实验方法。它是将多种凝集素同时预包被在同一玻璃板上，将预先进行抗体或染料标记的待测物加入凝集素芯片板上，即可利用凝集素对糖的特异性识别得出信号结果。自2005年报导以来，凝集素芯片被广泛应用于癌症、细菌、真菌、干细胞及糖尿病等相关研究中。但是作为一项高通量新技术，它的费用昂贵，更适用于科学研究而非临床检测。此外，现有的质谱检测和凝集素芯片检测技术均需对尿调蛋白进行分离纯化以排除其他蛋白干扰，无法直接使用尿液标本检测。尿调蛋白纯化需要收集大量尿液进行蛋白提取，更增加了检测的复杂程度。

技术实现思路

[0004]本专利技术基于凝集素检测原理及Sda抗原特殊性，提供了更加快速简单且花费少的Sda糖基化检测方法及试剂盒。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一种用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒。
[0006]本专利技术要求保护的用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获物和检测物。所述标准抗原为健康人尿调蛋白；所述捕获抗物为抗尿调蛋白抗体；所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素。
[0007]进一步地，所述抗尿调蛋白的抗体可为抗尿调蛋白的多抗。当然，也可以为具有等同效果的抗尿调蛋白的单抗。
[0008]在本专利技术的具体实施方式中，所述抗尿调蛋白上的抗体具体为Meridian公司生产的货号为K90071C
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1绵羊抗人尿调蛋白多抗。
[0009]进一步地，所述能够识别Sda的凝集素可为DBA(Vectorlabs，B
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5)。当然，也可以为具有等同效果的能够识别Sda的其他凝集素。
[0010]更进一步地，所述酶联免疫试剂盒中还可含有辣根过氧化物酶标记的亲和素和/或样本稀释液。
[0011]其中，所述亲和素为具有亲和素结合特性的物质。具体的，所述具有亲和素结合特性的物质可为链霉亲合素、卵白亲合素、卵黄亲合素或类亲合素。
[0012]在本专利技术的具体实施方式中，所述亲和素具体为链霉亲和素。
[0013]其中，所述样本稀释液为缓冲液。
[0014]在本专利技术的具体实施方式中，所述缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。
[0015]当然，所述酶联免疫试剂盒中还可含有如下中的至少一种：酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。
[0016]在本专利技术的具体实施方式中，所述铺板缓冲液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
[0017]在本专利技术的具体实施方式中，所述洗涤液为仅含有0.1％体积百分含量Tween 20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即0.1％PBST)。
[0018]在本专利技术的具体实施方式中，所述封闭液为仅含有10g/L BSA的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即1％BSA)。
[0019]在本专利技术的具体实施方式中，所述显色液为四甲基联苯胺(TMB)。
[0020]在本专利技术的具体实施方式中，所述终止液为1M H2SO4。
[0021]第二方面，本专利技术要求保护前文所述的酶联免疫试剂盒在检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量中的应用。
[0022]在所述应用中，以尿液为待测样本，经缓冲液稀释后进行检测。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述缓冲液为0.01M pH 7.4的PBS缓冲液。
[0024]在所述应用中，尿液标本不能用超纯水稀释，超纯水稀释检测体系测不出。
[0025]在所述应用中，可使用不同浓度的所述标准抗原对应检测出Sda抗原含量作为标准曲线(所述标准抗原为健康人尿调蛋白)。
[0026]第三方面，本专利技术要求保护前文所述的酶联免疫试剂盒在制备用于辅助诊断与尿调蛋白上的Sda糖抗原异常表达相关疾病的产品中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果：与现有的技术方案相比，该检测方法无需收取大量尿标本进行蛋白纯化，可直接使用少量尿液标本直接进行检测，这大大简化了检测流程。该检测方案要求设备及试剂简单易获取，使用该检测方法耗时少，花费低，便于临床开展。Sda抗原表达水平在肾损伤时发生改变，快速便捷的检测方法为临床早期诊断治疗争取了宝贵的时间。
附图说明
[0028]图1为本专利技术用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的检测原理示意图。
[0029]图2为本专利技术检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒的标准曲线。纵轴：Y(实测OD450值)；横轴：X(Sda糖抗原浓度U/μl)。
[0030]图3为使用本专利技术实施例建立的方法检测急性肾损伤AKI患者和健康人尿液中尿调蛋白上Sda糖抗原含量。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0032]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]实施例1用于检测尿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测尿液中尿调蛋白上的Sda糖抗原含量的酶联免疫试剂盒，包括标准抗原、捕获物和检测物；所述标准抗原为健康人尿调蛋白；所述捕获抗物为抗尿调蛋白的抗体，所述检测物为经生物素标记的能够识别Sda的凝集素。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗尿调蛋白的抗体为抗尿调蛋白的多抗。3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述能够识别Sda的凝集素为DBA。4.根据权利要求1
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3中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中还含有辣根过氧化物酶标记的亲和素和/或样本稀释液。5.根据权利要求1
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4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中还含有如下中的至少一种：酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、显色液和终止液。6.根据权利要求5所述的酶联免疫试...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈育青，宫坤婧，邢哲聿，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：