一种多基因串联法构建合成细菌纤维素植物的方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种多基因串联法构建合成细菌纤维素植物的方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术将acsAB基因、acsC基因和acsD基因进行结合，并根据作物的密码子偏好性进行密码子优化，优化后的基因分别与35S启动子和NOS终止子融合，构建得到3个基因表达盒，再连接入植物表达载体，获得含上述三基因表达盒的多基因植物转化载体，再转化至水稻，获得能合成细菌纤维素的转基因水稻。最终通过测定得出转基因水稻中的细菌纤维素含量达到3.81％。进一步测定发现该转基因水稻秸秆造出的纸张在各方面性能上均优于野生型水稻秸秆纸张。面性能上均优于野生型水稻秸秆纸张。面性能上均优于野生型水稻秸秆纸张。

【技术实现步骤摘要】
一种多基因串联法构建合成细菌纤维素植物的方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种多基因串联法构建合成细菌纤维素植物的方法和应用。

技术介绍

[0002]细菌纤维素(bacterial cellulose，简称BC)由微生物菌株发酵合成，原料来源广泛，早期由英国科学家Brown发现，他在研究木醋杆菌时无意发现培养液表面形成的一层固体凝胶物质，这在经相应表征后被确定为一种高纯度纤维素，即“细菌纤维素”。细菌纤维素与植物纤维素结构相似，但物理性质和化学性质有较大区别，不含半纤维素、果胶、木质素等。
[0003]细菌纤维素的生产过程简单且对环境无污染，能够形成天然3D纳米纤维交织结构，具有高结晶度、高机械强度、良好的生物相容性和可降解性等自身独特性，广泛应用于食品、医药、化工等领域，是一种可持续利用的功能生物材料。
[0004]细菌纤维素的优良特性给各领域都提供了材料，传统方法中常采用单糖作为碳源来制备培养基合成细菌纤维素，但存在成本高的问题，不利于其大规模化发展，因此如何低成本高效率地生产细菌纤维素成为目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种多基因串联法构建合成细菌纤维素植物的方法和应用，在植物秸秆中高量表达细菌纤维素，不仅提高了秸秆的利用价值，而且避免了秸秆用于焚烧造成的环境污染，从而大大提高了社会和经济效益。
[0006]本专利技术提供了一组在植物基因组中串联表达合成细菌纤维素的基因组合，所述基因组合包括acsAB基因、acsC基因和acsD基因。
[0007]优选的，所述acsAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，acsC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，acsD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0008]本专利技术还提供了利用上述基因组合构建得到的多基因表达盒，所述基因在构建多基因表达盒时，还需要对所述基因组合进行密码子优化。
[0009]本专利技术还提供了上述多基因表达盒的构建方法，将经密码子优化后的acsAB基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsABS基因表达盒；
[0010]将经密码子优化后的acsC基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsCS基因表达盒；
[0011]将经密码子优化后的acsD基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsDS基因表达盒。
[0012]优选的，所述经密码子优化后的acsAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经密码子优化后的acsC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，经密码子优化后的acsD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]优选的，所述35S启动子来源于花椰菜花叶病毒；所述NOS终止子来源于根农杆菌。
[0014]本专利技术还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组植物转化载体。
[0015]本专利技术还提供了上述重组植物转化载体的构建方法，包括以下步骤：将上述构建方法得到的acsABS基因表达盒、acsCS基因表达盒和acsDS基因表达盒按acsABS
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acsCS
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acsDS依次连接，然后插入pCAMBIA1301载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间，得pCAMBIA1301
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acsABS
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acsCS
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acsDS重组植物转化载体。
[0016]本专利技术还提供了上述基因组合或上述多基因表达盒或上述重组植物转化载体在促进作物产生细菌纤维素中的应用。
[0017]有益效果：本专利技术提供了一组在植物基因组中串联表达合成细菌纤维素的基因组合，将acsAB、acsC和acsD基因结合，根据目标植物的密码子偏好性进行密码子优化后分别构建基因表达盒，并将三个基因表达盒串联入植物转化载体中，得到重组植物转化载体。本专利技术实施例中，将经密码子优化后的基因分别与花椰菜花叶病毒的35S启动子和根农杆菌的NOS终止子融合，构建基因表达盒，再连接入植物表达载体获得多基因植物转化载体，转化至水稻，获得能合成细菌纤维素的转基因水稻。通过PCR验证表明外源基因均完整整合进了水稻基因组中，并按照GB/T 2677.10
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1995对转基因水稻秸秆进行总纤维素含量的测定，显示转基因水稻的总纤维素含量为65.13％，其中细菌纤维素含量为3.81％。利用本专利技术的方案，可创制合成细菌纤维素水稻新种质，为生产细菌纤维素作为反应器，大大提高水稻尤其是水稻秸秆的附加值，创造了良好的社会和经济效益。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为本专利技术中三个基因(acsABS、acsCS和acsDS)植物转化载体结构示意图；
[0020]图2为PCR电泳图(M:15000bp DNAmarker；WT:野生型水稻；1,2,3：转基因水稻)
[0021]图3为总纤维素含量对比图。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一组在植物基因组中串联表达合成细菌纤维素的基因组合，所述基因组合包括acsAB基因、acsC基因和acsD基因。
[0023]在本专利技术中，acsAB基因、acsC基因和acsD基因这三个基因编码的酶是细菌纤维素合成的关键酶，其中acsAB基因编码的酶是细菌纤维素合成酶，助于合成细菌纤维素，acsC基因编码的酶参与细胞膜通道用来分泌纤维素，acsD基因编码的酶参与纤维素结晶为纳米纤维的过程。本专利技术中所述acsAB基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，acsC基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，acsD基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。
[0024]本专利技术还提供了利用上述基因组合构建得到的多基因表达盒，所述基因在构建多基因表达盒时，还需要对所述基因组合进行密码子优化。
[0025]本专利技术优选根据目标植物的密码子偏好性进行密码子优化，实施例中以水稻为目
标植物进行遗传转化，因此根据水稻的密码子偏好性进行所述密码子优化，优化按照以下原则进行：(一)优化基因密码子，按照水稻密码子偏爱，提高基因翻译效率；(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(四)使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(五)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。本专利技术所述经密码子优化后的acsAB基因(简称acsABS基因)的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示，经密码子优化后的acsC基因(简称acsCS基因)的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组在植物基因组中串联表达合成细菌纤维素的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括acsAB基因、acsC基因和acsD基因。2.根据权利要求1所述基因组合，其特征在于，所述acsAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，acsC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，acsD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.利用权利要求1或2所述基因组合构建得到的多基因表达盒，其特征在于，所述基因在构建多基因表达盒时，还需要对所述基因组合进行密码子优化。4.权利要求3所述多基因表达盒的构建方法，其特征在于，将经密码子优化后的acsAB基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsABS基因表达盒；将经密码子优化后的acsC基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsCS基因表达盒；将经密码子优化后的acsD基因与35S启动子和NOS终止子融合成acsDS基因表达盒。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述经密码子优化后的acsAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经密码子优化后的acsC基...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永生，邓永东，姚泉洪，彭日荷，张文慧，付晓燕，许晶，王波，李振军，高建杰，韩红娟，王丽娟，王宇，左志豪，钱岑，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：