一种热稳定性及比酶活显著提高的醇酰基转移酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性及比酶活显著提高的醇酰基转移酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明专利技术将来源于异常威克汉姆酵母YF1503的醇酰基转移酶Eat276作为亲本，通过计算机辅助理性设计的方法构建了单点突变体R261L和组合突变体Eat276_D(R261L

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性及比酶活显著提高的醇酰基转移酶突变体


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种热稳定性及比酶活显著提高的醇酰基转移酶突变体。

技术介绍

[0002]醇酰基转移酶(alcohol acyltransferase，AATs，EC 2.3.1.84)能够催化酰基辅酶A与醇类进行缩合反应生成酯。作为短链脂肪酸酯生物合成的关键工具酶，醇酰基转移酶引起了越来越多的关注。对于大多数工业酶，反应速度将随着催化温度增加而显著提高，但是酶在较高温度下会因构象变化而破坏蛋白结构，影响酶活甚至导致失活。
[0003]已有的醇酰基转移酶普遍存在热稳定性较差，并且比酶活不高的问题。这使醇酰基转移酶在工业应用过程中存在诸多限制。因此，如何提高醇酰基转移酶的热稳定性及酶活性已成为研究重点。
[0004]通常来说，酶的热稳定性改造策略主要包括定向进化，半理性设计和理性设计。定性进化试验周期长，耗时耗力，改造效率较低；理性设计需要对酶分子结构及结构与功能之间的关系有足够深入的了解。因此，开发有效的提高醇酰基转移酶热稳定性及酶活性的改造策略，对于改善醇酰基转移酶的应用前景十分必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种热稳定性及比酶活显著提高的醇酰基转移酶突变体。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术公开了一种异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)YF1503来源的醇酰基转移酶基因Eat276，该基因的核苷酸酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。醇酰基转移酶突变体Eat276_D，该突变体为原酶氨基酸序列第89位的M置换为P，第161位的F置换为L第261位的R置换为L，该突变体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，该突变体编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
[0008]本专利技术还公开了含有醇酰基转移酶基因Eat276和醇酰基转移酶突变体基因Eat276_D的重组表达载体，该表达载体为优选地pET
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Eat276和pET
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Eat276_D大肠杆菌表达载体。pET
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Eat276和pET
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Eat276_D大肠杆菌表达载体的重组细胞系，优选地重组细胞系为大肠杆菌。
[0009]本专利技术还公开了醇酰基转移酶突变体的制备方法在提高醇酰基转移酶热稳定性中的应用；醇酰基转移酶突变体在制备乙酸酯中的应用；含有pET
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Eat276_D大肠杆菌表达载体的基因工程菌在发酵生产乙酸酯中的应用。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0011]本专利技术综合了Fireprot和Hotspot Wizard两种计算辅助理性设计的方法提高醇酰基转移酶的热稳定性。通过初筛获得热稳定性和酶活性显著提高的突变体；在此础之上，进一步通过组合突变，得到热稳定性和酶活同时大幅提高的组合突变体Eat276_D(R261L
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M89P
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F161L)。相较原酶，突变体Eat276_D的酶活提高了4.9倍，同时最适反应温度提高了10℃，Tm提高了8.4℃。这一发现对于醇酰基转移酶的工业化应用开发具有重要价值。
附图说明
[0012]图1为醇酰基转移酶突变体构建及诱导表达
[0013]图2为醇酰基转移酶突变体粗酶液酶活测定
[0014]图3为醇酰基转移酶突变体纯化电泳图
[0015]图4为醇酰基转移酶突变体Tm值测定
[0016]图5为醇酰基转移酶组合突变体构建及表达纯化
[0017]图6为醇酰基转移酶组合突变体酶活测定
[0018]图7为醇酰基转移酶组合突变体Tm值测定
[0019]图8为醇酰基转移酶组合突变体最适反应温度
具体实施方式
[0020]下面结合具体的附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
[0021]实施例1 醇酰基转移酶突变体构建
[0022]1.定点突变策略
[0023]利用Alphafold2预测出异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)YF1503来源的醇酰基转移酶Eat276三维结构模型，借助网络服务器HotSpot Wizard(https：//loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)和FireProt(https：//loschmidt.chemi.muni.cz/fireprot/)筛选分析Eat276潜在的重要突变位点。根据代表吉布斯自由能变的FoldX值和Rosetta值的大小进行排序，选择排名靠前的进化突变和能量突变的突变体。另外，利用Pymol对筛选得到的潜在突变位点在三维结构中的位置进行分析，排除距离催化三联体(S121，D145，H295)以内的残基。结果显示(表1)，经Fireprot预测筛选选取了10个突变位点，经Hotspot Wizard预测筛选得到8个突变位点，最终共确定18个位点进行定点突变。
[0024]表1 根据Fireprot和Hotspot Wizard的折叠自由能筛选
[0025][0026][0027]注：n.a.表示该项参数程序没有提供
[0028]2.突变体重组质粒构建
[0029](1)重组质粒克隆
[0030]以重组质粒pET
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Eat276核苷酸序列为模板，设计含有突变位点的引物(表2)，利用PCR聚合酶PrimeSTAR进行全质粒PCR。PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为98℃ 30s；98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 2min；4℃，保存。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图1)。
[0031](2)模板质粒消化
[0032]向PCR产物中加入限制性内切酶Dpn I，去除模板质粒。反应体系如表4所示。反应条件为37℃，30min。
[0033]表2 引物序列
[0034][0035][0036]表3 全质粒PCR扩增反应体系
[0037][0038]表4 模板质粒消化反应体系
[0039][0040](3)重组质粒转化
[0041]将完成消化的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞，涂布于含有硫酸卡那霉素的LB固体培养基。挑取菌斑，经菌落PCR验证后，进行测序鉴定。
[0042]3.诱导表达
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)YF1503来源的醇酰基转移酶基因Eat276，其特征在于，该基因的核苷酸酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.由权利要求1所述的醇酰基转移酶基因Eat276编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。3.由权利要求2所述的醇酰基转移酶突变体Eat276_D，其特征在于，SEQ.ID.NO.2中的第89位的M置换为P，第161位的F置换为L第261位的R置换为L，该突变体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。4.由权利要求3所述的醇酰基转移酶突变体Eat276_D的编码基因，其特征在于，该突变体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。5.含有权利要求1所述的醇酰基转移酶基因Eat276的重组表达载体，其特征在于，该表达载体为优选地pET
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Eat...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀婷，富志磊，倪冰倩，卢宏运，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：