本发明专利技术涉及一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用，属于分子生物学基因工程技术领域。为解决现有技术仍未能将南果梨酯类香气相关ATT基因应用于果实香气含量提升的问题，本发明专利技术提供了一种南果梨PuAAT基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供了一种包括所述的南果梨PuAAT基因的过表达载体，通过农杆菌介导转化法将含有南果梨PuAAT基因的过表达载体转入南果梨果实，研究表明该基因具有促进南果梨酯类香气合成的功能，经过比较分析证明，转基因果实的酯类香气物质含量明显提高。本发明专利技术为果实香气的调控提供了理论依据与技术手段，具有较大的应用价值。较大的应用价值。较大的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用
[0001]本专利技术属于分子生物学基因工程
，尤其涉及一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用。
技术介绍
[0002]南果梨(Pyrus ussuriensis)是蔷薇科、梨属植物，属于典型的呼吸跃变型果实，采后常温自然后熟10
‑
15d左右果实熟至最佳食用期，具有浓郁而怡人的香味，是进行梨果实香气研究的难得试材。香气是果实的重要品质指标之一，直接影响果实的经济价值，酯类香气物质是香气的重要来源。前期研究发现南果梨酯类香气物质中己酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯三种物质含量最高。
[0003]醇酰基转移酶(AlcoholAcetyltransferase，AAT)是酯类香气物质合成代谢通路最末端的关键酶，在酯类合成中起重要作用。AAT是BAHD家族中一个成员，其氨基酸序列中含有HXXXD和FGWG两个高度保守基序。对醇酰基转移酶AAT基因进行功能研究，阐明其香气调控机理，能够在分子水平调控南果梨香气合成的机理提供理论基础。但现有技术仍未能将南果梨香气相关AAT基因应用于果实香气含量的提升。
技术实现思路
[0004]为解决现有技术仍未能将南果梨酯类香气相关ATT基因应用于果实香气含量提升的问题，本专利技术提供了一种南果梨PuAAT基因、其过表达载体及应用。
[0005]本专利技术的技术方案：
[0006]一种南果梨PuAAT基因，所述南果梨PuAAT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]进一步的，所述南果梨PuAAT基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，所述过表达载体包括所述的南果梨PuAAT基因。
[0009]进一步的，所述过表达载体为在植物表达载体pRI101
‑
CaMV35S中插入所述的南果梨PuAAT基因构建而成。
[0010]进一步的，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：
[0011]步骤1、以南果梨总RNA为模板反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，利用PuAAT引物组进行PCR扩增，得到南果梨PuAAT基因；
[0012]步骤2、将步骤1得到的南果梨PuAAT基因与植物表达载体pRI101
‑
CaMV35S连接，得到过表达载体pRI101
‑
CaMV35S
‑
PuAAT。
[0013]进一步的，所述PuAAT引物组包括引物PuAAT
‑
F和引物PuAAT
‑
R；
[0014]所述引物PuAAT
‑
F的核苷酸序列为：5＇
‑
ATGATGCCACTCTCAGTACT
‑
3＇；
[0015]所述引物PuAAT
‑
R的核苷酸序列为：5＇
‑
TTACATCATTGACATGATCC
‑
3＇。
[0016]一种南果梨PuAAT基因在提高果实香气中的应用，所述果实为南果梨果实、西洋梨或金冠苹果。
[0017]一种南果梨PuAAT基因的过表达载体在提高果实香气中的应用，所述果实为南果梨果实、西洋梨或金冠苹果。
[0018]进一步的，将携带南果梨PuAAT基因的过表达载体pRI101
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CaMV35S
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PuAAT转入农杆菌中，采用农杆菌介导法瞬时侵染南果梨果实。
[0019]进一步的，所述农杆菌介导法瞬时侵染是将含有过表达载体pRI101
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CaMV35S
‑
PuAAT的农杆菌注射入南果梨果实中。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术利用植物基因工程技术，通过基因表达分析、基因克隆及序列分析技术，从南果梨中分离鉴定得到南果梨酯类香气合成相关基因PuAAT的序列信息，并构建了一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，通过农杆菌介导转化法将含有南果梨PuAAT基因的过表达载体转入南果梨果实，研究表明该基因具有促进南果梨酯类香气合成的功能，经过比较分析证明，转基因果实的酯类香气物质含量明显提高。本专利技术为利用基因工程技术，对果实香气的调控提供了理论依据与技术手段，具有较大的应用价值。
附图说明
[0022]图1为实施例1中PuAAT基因cDNA序列的扩增结果照片，其中M为DL2000；
[0023]图2为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中PuAAT基因表达量对比图；
[0024]图3为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中酯类香气物质含量对比图。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本专利技术实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本专利技术实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1
[0027]本实施例提供了南果梨香气相关PuAAT基因的克隆方法。
[0028]以南果梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)果实为试验材料进行RNA提取。
[0029]采用CTAB法(Li et al.,2013)，提取南果梨果实中的总RNA。以所得总RNA为模板用反转录试剂盒(PrimeScriptTM RTreagent Kitwith gDNAEraser)反转录得到cDNA。
[0030]以反转录得到的cDNA为模板，利用PuAAT引物组进行PCR扩增。
[0031]PuAAT引物组包括引物PuAAT
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F和引物PuAAT
‑
R；
[0032]所述引物PuAAT
‑
F的核苷酸序列为：5＇
‑
ATGATGCCACTCTCAGTACT
‑
3＇；
[0033]所述引物PuAAT
‑
R的核苷酸序列为：5＇
‑
TTACATCATTGACATGATCC
‑
3＇。
[0034]本实施例中PCR扩增的反应体系为：2
×
ExTaq
TM Mix 25.0μL、PuAAT
‑
F 2.5μL、PuAAT
‑
R 2.5μL、cDNA 1μL、ddH2O 19μL，共50.0μL。
[0035]PCR扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min20s，返回第二步(95℃，30s)进行35个循环；72℃，5min，4℃保存。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种南果梨PuAAT基因，其特征在于，所述南果梨PuAAT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述一种南果梨PuAAT基因，其特征在于，所述南果梨PuAAT基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包括权利要求1所述的南果梨PuAAT基因。4.根据权利要求3所述一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体为在植物表达载体pRI101
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CaMV35S中插入权利要求1所述的南果梨PuAAT基因构建而成。5.根据权利要求4所述一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：步骤1、以南果梨总RNA为模板反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，利用PuAAT引物组进行PCR扩增，得到南果梨PuAAT基因；步骤2、将步骤1得到的南果梨PuAAT基因与植物表达载体pRI101
‑
CaMV35S连接，得到过表达载体pRI101
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CaMV35S
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PuAAT。6.根据权利要求5所述一种南果梨PuAAT基因的过表达载体，其特征在于，所述PuAAT引物组包括引物PuAAT
...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹赜鹏，李晓晶，臧楠楠，齐力永，杨月明，张卓冉，赵丽红，孙祎擎，赵思婷，王宝锋，张淼，王爱德，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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