一种检测筛查新冠病毒Delta毒株L452R突变和T478K突变的方法及试剂盒技术

一种检测筛查新冠病毒Delta毒株L452R突变和T478K突变的方法及试剂盒，包括核酸提取得到待检核酸；以设计的引物进行扩增反应，得到核酸扩增产物；配置CRISPR反应混合液，2μL核酸扩增产物加入到第一CRISPR反应混合液或第二CRISPR反应混合液，37℃孵育30分钟，通过荧光读取检测结果。本发明专利技术具有检测速度快、准确度高、成本低以及多场景实时检测的优点。成本低以及多场景实时检测的优点。成本低以及多场景实时检测的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测筛查新冠病毒Delta毒株L452R突变和T478K突变的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种检测筛查新冠病毒Delta毒株L452R突变和T478K突变的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(COVID
‑
19)，简称“新冠病毒”，是一种新发现的单链RNA病毒，全长29903个核苷酸，通过飞沫经呼吸道与结膜传播，传染性强，传播范围广，是目前已知的第七种对人类致病的冠状病毒。相比于其它冠状病毒造成的急性症状，新型冠状病毒感染症状从轻微、咳嗽、发烧到危重均有出现，感染症状和常见呼吸系统疾病相似，隐蔽性强，传染性极强。
[0003]随着新冠病毒的传播，全球已监测到数千种新冠病毒突变。绝大部分突变并不会导致病毒特性的改变，但是部分位于新冠病毒S蛋白上的特殊突变可能使病毒更具危害性。新冠病毒S蛋白(刺突蛋白)是病毒最外层结构的组成部分，新冠病毒通过表面蛋白识别宿主细胞表面的hACE2受体从而入侵细胞。人体也是通过识别病毒表面抗原从而产生相应抗体来实现病毒免疫。目前大多数的新冠疫苗也是针对新冠病毒S蛋白设计的。因此发生在新冠病毒S蛋白上的突变可能导致相应氨基酸的改变，从而使病毒入侵方式更具传染性。氨基酸的改变可能导致病毒抗原表位的变化从而使疫苗诱导的保护性抗体失效。
[0004]德尔塔(Delta)是新冠病毒变异毒株，最早于2020年10月在印度被发现，这一变异毒株被世卫组织命名为B.1.617.2，并在5月31日用希腊字母δ(德尔塔)命名。德尔塔毒株有以下显著特点：1.传播能力强，比在英国发现的阿尔法毒株传播能力提高超过40％；2.潜伏期或者传代间隔缩短，病毒传播速度在加快；3.病毒载量高：感染者样本PCR检测病毒结果显示，病毒载量有显著增加。患者的Ct值非常低，Ct值越低就表示体内病毒载量越高，患者核酸转阴所需要的时间延长。Delta变体包含RBD突变L452R、RBD突变T478K等。Delta变体对一些抗NTD和抗RBD单克隆抗体的中和具有抗性，例如etesivimab、casirivimab和imdevimab三种抗体对Delta变体失去活性，并且这些抗体显示出与刺突蛋白的结合受损。对于mAb 7B8，T478K变体发生免疫逃脱；对于mAb 9G11，LL452R和E484的亲和力较低；突变L452R、T478K和E484Q远离mAb CB6的结合位点，导致免疫逃逸的发生。恢复期和疫苗血清对Delta变体的中和作用降低，恢复期血浆减少了2.7倍，辉瑞
‑
BioNTech疫苗减少了2.5倍，牛津
‑
阿斯利康疫苗减少了4.3倍。这表明该变体可发生免疫逃逸并使得疫苗免疫血清失效从而突破性感染疫苗接种群众。因此,Delta毒株的快速鉴定，为抗体治疗方案的选择提供参考、为疫情精准防控提供技术工具，对于避免大规模突破性感染意义重大。
[0005]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。单核苷酸多态性检测(SNP检测)是一种用来检测基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性的检测技术。SNP检测方法大致分为3类：
①
以凝胶为基础的已知多态性检测，包括聚合酶链反应、限制性片段长度多态性标记、
寡核苷酸连接分析和小测序等；
②
非凝胶高通量的检测技术，包括荧光能量共振转移的检测法、质谱技术和DNA芯片等；
③
构象为基础的未知突变检测，包括单链构象多态性、化学或酶错配修饰分析、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱等。目前，新冠病毒突变的监控主要依赖高通量测序鉴别SNP，虽然准确度较高，但是检测周期长达7天且成本昂贵，无法适用于新冠病毒突变的快速筛查。因此，研发一种速度快、准确度高、成本较低的快速SNP检测筛查新冠病毒突变方法，意义重大。
[0006]CRISPR是“Clustered regularly interspaced short palindromic repeats”缩写，指规律成簇的间隔短回文重复。Cas是“CRISPR
‑
associated”缩写，为CRISPR相关。CRISPR/Cas系统是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御噬菌体入侵的适应性机制，后被发现并发展成为一种由引导RNA指引Cas核酸酶对靶向基因进行特定核酸编辑的技术。CRISPR/Cas系统的工作原理是crRNA(CRISPR
‑
derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans
‑
activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶如Cas9蛋白至与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。目前，基于CRISPR的核酸快速检测技术主要分为两大类，即2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna开发的依赖于Cas12a的称为DETECTR的核酸恒温检测技术，以及CRISPR专利所有者张锋开发的依赖于Cas13a的称为SHERLOCK的核酸恒温检测技术。其原理都是通过恒温扩增方法如RPA对目的片段进行扩增富集，扩增后的目的片段会被Cas蛋白通过一段crRNA的引导靶向识别，激活Cas蛋白成为一个DNA切割机(Cas12a)或者RNA切割机(Cas13a)，将附近所有的单链DNA(Cas12a)或者单链RNA(cas13a)进行切割。这一特性作用于单链核酸荧光探针则可用于报告检测结果。
[0007]CRISPR/Cas系统的切割检测需要CRISPR靶向RNA(crRNA)结合识别靶向序列并激活Cas蛋白后才能进行，单碱基突变(SNP)检测则利用crRNA的碱基识别特异性，通过将突变碱基置于crRNA的不同位置或者人为引入碱基错配，使得crRNA仅能识别突变序列而不能识别不含SNP的原始序列，从而实现突变分型检测。
[0008]如图1所示，分别展示了LwaCas13a以及LbaCas12a区分SNP的模式原理。Cas12a的SNP区分：PAM(Protospacer adjacent motif)是crRNA靶向结合区域(spacer)附近的一段固定短序列(TTTN)。PAM及靠近PAM的1
‑
6个碱基的种子区(seed region)对LbaCas12a的识别与激活至关重要，PAM及seed region处的碱基错配可使LbaCas12a蛋白的切割活性下降约1000倍。通过将突变碱基放置在PAM或seed region区域可极大地影响LbaCas12a的激活从而进行SNP鉴定。Cas13a的SNP区分：不同于LbaCas12a对单碱基的高度灵敏性，LwaCas13a没有类似于PAM的区域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
inhibitor、0.1μL的浓度为50U/μL的T7 RNA polymerase、0.1μL的浓度为100μM的DNA荧光探针、0.1μL的浓度为100μM的RNA荧光探针和8.92μL的无RNA酶水混合；两种CRISPR特异性检测的crRNA：L452R
‑
Cas13
‑
crRNA：5
’‑
ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuauuccgguaauuauaauuaccaccaac
‑3’
；T478K
‑
Cas12
‑
crRNA：5
’‑
guaauuucuacuaaguguagauguaccggccugauagauuuc
‑3’
；两种荧光探针：RNA荧光探针：5
’‑
FAM
‑
mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA
‑
BHQ1
‑3’
；其中，m代表2位氧甲基修饰，r代表核糖核苷酸；DNA荧光探针：5
’‑
VIC
‑
TTATTATT
‑
BHQ1
‑3’
；步骤4：取2μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜忆南，宗凯，周静，邢晨，祝亚亭，王小凤，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：