一种基于CRISPR技术检测甘薯潜隐病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯潜隐病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR技术检测甘薯潜隐病毒的方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测甘薯潜隐病毒的方法、系统和试剂盒。

技术介绍

[0002]甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus，SPLV)，属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，是侵染甘薯的主要病害之一。甘薯潜隐病毒单独侵染大多数甘薯品种时不产生明显症状，但是可以与甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯G病毒等共侵染，产生协生病害，导致甘薯产生严重的病毒病症状。甘薯潜隐病毒的昆虫传毒介质为蚜虫，并且可随薯苗营养繁殖体及薯块进行传播。
[0003]甘薯潜隐病毒的检测方法主要有：血清学法、RT
‑
PCR法、LAMP快速检测法、核酸斑点杂交检测法。
[0004]本专利技术提供了一种新型的检测甘薯潜隐病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种基于CRISPR技术进行甘薯潜隐病毒检测的方法、系统和试剂盒。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种用于检测甘薯潜隐病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯潜隐病毒的核酸。
[0007]本专利技术中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。
[0008]在一个实施方式中，所述gRNA自5
’
端至3
’
端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。
[0009]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6、7任一所示的序列。
[0010]在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17
‑
30个碱基，例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。
[0011]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
13个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6、7任一所示的序列。
[0012]在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基(例如，1、2、3、4、5
个碱基)。
[0013]所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0014]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
‑
7任一所示。
[0015]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0017]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.8所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯潜隐病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯潜隐病毒或甘薯病害。
[0019]在一个实施方式中，所述V型Cas蛋白选自以下任意一种：
[0020]I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0021]II、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2相比，在对应于SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第851位氨基酸存在突变。
[0022]在一个实施方式中，所述第851位氨基酸位点突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，S，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，所述第851位氨基酸突变为R。
[0023]应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。领域技术人员能够理解，本专利技术Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r
‑
DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
[0024]本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本专利技术Cas突变蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
[0025]本专利技术中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘薯潜隐病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯潜隐病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有17
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
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7任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
13个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
‑
5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
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7任一所示。2.一种检测/诊断甘薯潜隐病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、权利要求1所述的gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯潜隐病毒或甘薯病害。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自以I
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II任意一种：I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；II、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，在对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，赵莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：