来自完整组织样品的生物材料的空间依赖性分析制造技术

生物学研究需要从组织样品中分离和分析材料，例如RNA、DNA和蛋白质。本文所述的方法和组合物允许对大且完整的组织样品进行高分辨率成像，并随后以精确和位置依赖性方式分离材料。本文所述的方法和组合物可用于例如生物标志物的发现、细胞群的鉴定、病理学分析和特定目标区域中表达数据的产生。目标区域中表达数据的产生。目标区域中表达数据的产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自完整组织样品的生物材料的空间依赖性分析
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年3月18日提交的美国临时申请号62/991,583和2020年9月4日提交的美国临时申请号63/074,693的优先权，这些美国临时申请中的每一者整体并且出于所有目的并入本文。

技术介绍

[0003]在大多数基于分子生物学的组织分析方法中，被分析材料的空间上下文会丢失。本领域已知的将序列分析与空间信息相结合的技术具有局限性，例如，低测序深度、样品体积限制、单个组织切片的分析或耗时的读出，以及其他约束。目前，据我们所知，没有可用的方法将分离精度与分析深度相结合。本文所述的方法和组合物解决了本领域中的这些和其他问题。

技术实现思路

[0004]本技术一般涉及用于对组织或组织样品的细胞或其他区域进行三维标记的方法和组合物。该方法包括对透明化的组织或样品进行成像，该透明化的组织或样品已通过以下进行标记：使目标区域(或细胞)与适当的标记接触，然后使所述目标区域(或细胞)经受多光子激光。然后可以从组织或样品中分离经标记区域并进行分析，诸如但不限于DNA测序、RNA测序、蛋白质组学分析、表观遗传学分析、免疫组织化学分析、染色体构象捕获或免疫荧光分析。可以使用各种分离目标经标记区域(或细胞)的方法，诸如但不限于激光辅助显微切割术、荧光辅助细胞分选(FACS)、磁活化细胞分选(MACS)或浮力活化细胞分选(BACS)。此类分析可以提供关于组织或样品的离散区域的信息。
[0005]在一方面，提供了一种用于标记组织或组织样品的区域的方法。该方法可以包括：a)提供三维组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；和d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域。
[0006]在另一方面，提供了一种用于完整组织或组织样品的三维表达谱分析的方法。该方法可以包括：a)提供三维完整组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；d)使组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记该区域；e)对经标记区域进行成像以创建图像；f)从组织或组织样品中分离标记区域；g)确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成；h)使图像与分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成组合，以创建完整组织或组织样品的三维表达谱。
[0007]在一方面，提供了一种用于分离组织或组织样品中的单个细胞或细胞核的方法。该方法可以包括：a)提供包含目标细胞或细胞核的三维组织或组织样品；b)透明化样品；c)使组织或组织样品与光活化标记接触；d)使细胞或细胞核经受多光子激光，从而标记细胞或细胞核；e)从组织或组织样品中解离标记的细胞核；和f)分离经标记细胞或细胞核。
[0008]在另一方面，提供了一种组合物。该组合物可以包括组织样品、具有与组织相似或匹配的折射率的培养基以及光活化标记。
[0009]在一方面，提供了透明化的组织样品。透明化的组织样品可以包括光活化标记和具有与组织的折射率基本匹配的折射率的培养基。
附图说明
[0010]图1示出了组织透明化之前(左)和之后(右)的小鼠大脑。
[0011]图2是一系列荧光显微镜图片，示出了不同荧光蛋白在透明化的组织(下排)或对照组织(上排)中的稳定性。在该图中，293T细胞分别用在CMV启动子控制下驱动EGFP、mKate2、tdTomato或Venus的表达的质粒转染。
[0012]图3A至图3B是示出使用双光子显微镜以使用光反应性标记来标记透明化的组织中的目标细胞或细胞核的实施例的图。图3A是示出当标记暴露于波长在260nm和475nm之间的光时，用具有光反应性基团和生物素标签的光反应性标记标记分子的图。图3B是展示了与传统共聚焦显微镜(左)相比，使用双光子显微镜(右)标记目标细胞或细胞核的优势的图。传统的共聚焦显微镜会导致暴露于光(红色)和光激活化合物(绿色)的组织的整个区域发生光激活。相比之下，双光子显微镜允许更准确的光激活和靶标位点(红星)，从而避免非靶标组织的非特异性标记。
[0013]图4展示了使用双光子标记技术的示例性分析的概述。具有三维(3D)细胞结构的组织进行透明化，浸泡在光活化染料(例如，光生物素)中，使用双光子激光标记(例如，如图3B所示)，然后分离标记的细胞核用于分析，例如单细胞分析(例如，SPLiT
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seq)。
[0014]图5示出了在室温(RT)或4℃(4C)三天后，在逆转录后未经EDC处理的处理样品的多核苷酸长度谱。
[0015]图6A至图6C展示了对来自完整组织样品的生物材料进行空间依赖性分析的方法的概述。图6A示出了示例性组织透明化(图6A，小图A)和标记过程(小图B至小图E)，以及经光标记细胞核的分离(小图F)。由此产生的样品可以通过从分离的经光标记细胞核(小图G和小图H)制备的SPLiT seq文库进行分析，随后进行数据分析(I)。此外(或替代地)，可以分析来自分离的组织的DNA(图6B)或蛋白质(图6C)。
[0016]图7A至图7C通过SPLiT
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seq分析示出了经福尔马林固定的和透明化的样品的RNA质量。图7A是示出了每个条形码的唯一计数(log2(UMI))相对于条形码等级(条形码log10标度)的图。图7B是散点图，在y轴上示出固定的样品的log2(TPM)，在x轴上示出透明化的样品的log2(TPM)(TPM：每百万个转录本)。图7C示出了一个示例性基因组浏览器窗口，展示了小鼠(mm10)染色体2(顶部)的72kb片段的cDNA覆盖率，并比较了固定的且透明化的(中心)样品和固定的(底部)样品。如图7A至图7C所示，脊髓在Cy3
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PA中被光活化。提取细胞核并分类用于标记并入。生成SPLiT
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seq文库并通过HiSeq测序。
[0017]图8A至图8C示出了使用双光子标记的脊髓组织。图8A是小鼠脊髓的横截面图，示出了脊髓的不同区域，背侧层用彩色圆圈指示。在放大的小图中，突出显示了经受光激活的区域。图8B是从小鼠脊髓分离的透明化的但不是光活化的细胞核的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了用于本实验的PA染料：Cy3
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PA。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入的Cy3呈阳性(右)。图8C是从小鼠脊髓分离的透明化的且光活化的细胞核(如图9A所示)的FACS图。Y轴示出了DAPI(一种核复染剂)的信号，而X轴示出了用于本实验的PA染料：Cy3
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PA。方框指示单个细胞核对掺入的Cy3呈阴性(左)或对掺入
的Cy3呈阳性(右)。
[0018]图9A至图9C展示了用于本专利技术方法中的示例性化合物。图9A示出了可用于光标记的光反应性化合物的实例。图9B示出了对由紫外(UV)光诱导的芳基叠氮化物的示例性修饰。图9C示出了合成的光反应性化合物的实例。
[0019]图10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于标记组织或组织样品的区域的方法，其包括：a)提供三维组织或组织样品；b)透明化所述样品；c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；和d)使所述组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记所述区域。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述区域包括细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述亚细胞区室为细胞核。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括对所述组织或组织样品进行成像。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品为固定组织或固定组织样品。8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括可检测部分。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测部分包括发光部分。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述荧光部分包括荧光团。12.根据权利要求8所述的方法，其中所述可检测部分之一包括抗体或其官能性衍生物。13.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括标签。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签、寡核苷酸标签或生物素标签。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中样品透明化过程包括使所述样品脱水并且将所述样品转移到具有与所述组织相似或匹配的折射率的培养基中。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述折射率在约1.3与约1.6之间。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基包括苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)或其衍生物的溶液，含有或不含有三乙胺、二苯醚、二苄醚、α
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生育酚和/或Quadrol中的一种或多种。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养基包括BABB溶液。19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品通过叔丁醇溶液来脱水。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述叔丁醇溶液包括三甲胺、四氢呋喃、乙醇或甲醇。21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述光活化标记为疏水性的。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括苯基叠氮化物基团、邻羟基苯基叠氮化物基团、间羟基苯基叠氮化物基团、四氟苯基叠氮化物基团、邻硝基苯基叠氮化物基团、间硝基苯基叠氮化物基团、双吖丙啶基团、叠氮基甲基香豆素基团或补骨脂素基团。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述光活化标记包括芳基叠氮化物基团。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其进一步包括从所述组织或组织样品中分离经标记区域或所述经标记区域的一部分。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述经标记区域或部分通过针对所述标记的FACS分选来分离。26.根据权利要求24或25所述的方法，其进一步包括分析分离的经标记区域的组成以产生分析数据。27.根据权利要求26所述的方法，其中分析包括确定所述分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNA通过测序来分析。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述RNA通过SPLITseq来分析。30.根据权利要求27所述的方法，其中所述蛋白质通过质谱法来分析。31.根据权利要求27所述的方法，其中所述DNA通过DNA测序来分析。32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中在分离所述经标记区域之前对所述组织或组织样品进行了成像以创建图像，进一步包括使所述图像与所述分析数据组合以创建所述区域的三维组成图。33.一种用于完整组织或组织样品的三维表达谱分析的方法，其包括：a)提供三维完整组织或组织样品；b)透明化所述样品；c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；d)使所述组织或组织样品的区域经受多光子激光，从而标记所述区域；e)对经标记区域进行成像以创建图像；f)从所述组织或组织样品中分离所述经标记区域；g)确定分离的经标记区域的DNA、RNA和/或蛋白质组成；h)使所述图像与所述分离的经标记区域的所述DNA、RNA和/或蛋白质组成组合，以创建所述完整组织或组织样品的三维表达谱。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述区域为细胞、亚细胞区室、聚集体或分泌的聚集体。37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述分离的经标记区域为单个细胞核。38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的RNA组成。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述RNA组成通过测序来确定。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述RNA组成通过SPLITseq来确定。41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的蛋白质组成。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述蛋白质组成通过质谱法来确定。
43.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中确定所述分离的经标记区域的DNA组成。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述DNA组成通过DNA测序来确定。45.一种用于分离组织或组织样品中的单个细胞或细胞核的方法，其包括：a)提供三维组织或组织样品；b)透明化所述样品；c)使所述组织或组织样品与光活化标记接触；d)使细胞经受多光子激光，从而标记所述细胞；e)从所述组织或组织样品中解离经标记细胞；和f)分离所述经标记细胞或细胞核。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述多光子激光为双光子激光。47.根据权利要求45所述的方法，其中所述多光子激光为三光子激光。48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其进一步包括对所述组织或组织样品进行成像。49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，其中所述组织或组织样品为固定组织或固定组织样品。50.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括可检测部分。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述可检测部分包括发光部分。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述发光部分为荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或电化学发光部分。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述荧光部分包括荧光团。54.根据权利要求50所述的方法，其中所述可检测部分包括抗体或其官能性衍生物。55.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，其中所述光活化标记包括标签。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述标签选自包括以下项的组：亲和标签、表位标签、荧光标签或生物素标签。57.根据权利要求33至56中任一项所述的方法，其中样品透明化过程包括使所述样品脱水并且将所述样品转移到...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：