一种用3D模型检测CAR-T细胞在实体瘤中浸润的方法技术

本发明专利技术公开了一种用3D模型检测CAR

【技术实现步骤摘要】
一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测细胞的方法，具体涉及一种检测CAR
‑
T细胞的方法。

技术介绍

[0002]目前，肿瘤免疫治疗已经成为癌症领域进展最快的方面，而细胞治疗技术在其中发挥了重要作用，其主要包括CAR
‑
T，CAR
‑
NK，TCR
‑
T，TIL等类型。嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)主要通过其表面的嵌合抗原受体识别肿瘤特异/相关抗原，然后诱导T细胞内激活信号，启动对肿瘤细胞的特异性杀伤。CAR
‑
T在血液肿瘤已有多款产品上市，临床表现出了显著且持久的治疗效果，其在实体肿瘤中的应用也被广泛研究，有多款产品处于临床前和临床研究阶段。然而从已有的结果来看，CAR
‑
T在实体瘤中的效果明显弱于血液肿瘤，主要包括以下三个方面因素：1.实体肿瘤具有异质性，血液肿瘤通常表达单一的、肿瘤特异性/相关抗原，针对相关抗原的CAR
‑
T可以高效、全面地杀伤肿瘤细胞，而实体肿瘤则具有显著的抗原异质性；2.实体肿瘤具有免疫抑制微环境，在肿瘤团块内分布有多种免疫抑制细胞以及较高浓度免疫抑制因子，减弱了瘤内CAR
‑
T细胞的杀伤功能；3.实体肿瘤具有物理屏障，肿瘤细胞、成纤维细胞、细胞基质等组份阻碍了血液中CAR
‑
T细胞的有效进入，降低了其识别肿瘤抗原的概率。
[0003]针对CAR
‑
T在实体肿瘤治疗中遇到的问题，各个研究机构和公司对其进行了多方面的改造，其中增加CAR
‑
T对实体瘤浸润是重要的一个方面。已有研究指出，在CAR
‑
T细胞上过表达CCL19可以明显增加其瘤内浸润水平，在动物模型上也表现出了更强抑瘤效果。除了CCL19，还有CCL21、CXCR6、CXCR4等多种趋化因子或趋化因子受体可以增加CAR
‑
T对实体瘤的浸润，研究人员也在开发各种新的策略增加CAR
‑
T浸润能力。
[0004]当前评价CAR
‑
T细胞对实体瘤浸润能力，主要依靠的是动物模型中肿瘤免疫组化染色。首先构建荷瘤小鼠，然后静脉给予CAR
‑
T细胞，一段时间后取肿瘤组织进行T细胞免疫组化染色，通过观察瘤内T细胞染色强度，区分不同改造CAR
‑
T细胞对实体瘤的浸润能力。然而该方法需要构建均一的动物模型，成本较高，难度大，周期较长，难以大规模、高通量开展CAR
‑
T改造策略的评估。另外一种评估方法是采用体外细胞迁移Transwell实验，该方法把CAR
‑
T细胞2D培养在具有微孔的一侧平面上，一段时间后检测穿过微孔到达另外一侧的CAR
‑
T细胞数目，以此来间接评估不同CAR
‑
T细胞对实体瘤的浸润能力。该方法虽然成本低于动物实验，周期也较短，但是单独2D培养的CAR
‑
T细胞很难真实模拟实体瘤的情况，既没有靶细胞存在，无肿瘤微环境，也没有实体瘤物理屏障，且需要采用24孔以上的细胞培养板来减少孔内误差，高通量操作难度较高，实验结果难以反映临床情况。
[0005]基于以上种种不足，我们开发了一种利用3D肿瘤微球检测CAR
‑
T细胞在实体瘤浸润的方法。该方法用肿瘤细胞和成纤维细胞共培养，形成致密的3D肿瘤微球，构建肿瘤微环境以及实体瘤物理屏障，然后加入荧光标记的CAR
‑
T细胞，培养一段时间后进行细胞透明化处理，使用3D高内涵扫描成像以及特定的分析方法，获得肿瘤微球内部CAR
‑
T细胞荧光强度信息，以此来反映不同改造CAR
‑
T的浸润能力。该方法可在低吸附96孔板内进行，通量高，成
本低，时间短，有助于高效评估多种CAR
‑
T对实体瘤的浸润能力，帮助找到最有临床应用潜力的候选CAR
‑
T进行开发。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对传统方法成本高，通量低，不能准确反映临床真实情况等缺点。本专利技术通过构建肿瘤细胞混合成纤维细胞的3D肿瘤微球，建立肿瘤微环境和物理屏障，模拟临床上CAR
‑
T遇到的情况。然后通过荧光标记，肿瘤微球透明化处理，高内涵共聚焦扫描，断层分析等方法，快速、准确、可视化地评估3D微球内部CAR
‑
T的浸润水平，为CAR
‑
T在实体瘤的开发提供了坚实的技术支撑。本专利技术应用3D肿瘤微球培养技术以及细胞成像分析方法，检测常规和改造后的CAR
‑
T细胞对肿瘤微球的浸润程度，反映实体瘤中不同改造类型CAR
‑
T细胞的浸润能力。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法，基于体外3D肿瘤微球培养系统，通过CAR
‑
T荧光标记，高内涵共聚焦拍照，3D模型分析等技术，来评估CAR
‑
T细胞对实体瘤的浸润能力，具体包括以下步骤：
[0008]1.应用肿瘤细胞和成纤维细胞在低吸附U底板内共培养，形成3D肿瘤微球，建立肿瘤微环境和物理屏障；
[0009]2.通过提前对CAR
‑
T细胞进行无害化荧光染色，标记目标细胞，便于后续荧光观察和定量分析；
[0010]3.多聚甲醛固定3D肿瘤微球，并进行透明化处理，使CAR
‑
T荧光可以穿透微球被精确检测到；
[0011]4.使用高内涵共聚焦断层扫描方式，获得微球不同层面的CAR
‑
T浸润信息；
[0012]5.建立对核心层面的分析方法，去除球体表面结合CAR
‑
T的干扰，分析内部不同范围CAR
‑
T荧光强度，更准确地评估肿瘤微球内部浸润CAR
‑
T细胞的水平。
[0013]进一步的，本专利技术所使用的肿瘤细胞为CAR
‑
T的靶细胞，可以为过表达荧光蛋白以及靶抗原或内源性表达靶抗原的BxPc
‑
3、NCI
‑
N87、SHP
‑
77、NCI
‑
H82、MC38、LS174T和/或HepG2等细胞系。
[0014]进一步的，所使用的成纤维细胞可以为表达不同荧光蛋白的HDFα或MRC
‑
5细胞系。
[0015]进一步的，CAR
‑
T细胞荧光标记试剂可以为远红外细胞荧光染料(Far Red)或CFSE等对细胞没有损伤，且可以较长时间保持而不被多聚甲醛淬灭的荧光染料。
[0016]进一步的，多聚甲醛固定和透明化处理可以增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：1)应用肿瘤细胞和成纤维细胞在低吸附U底板内共培养，形成3D肿瘤微球，建立肿瘤微环境和物理屏障；2)通过提前对CAR
‑
T细胞进行无害化荧光染色，标记目标细胞，便于后续荧光观察和定量分析；3)多聚甲醛固定3D肿瘤微球，并进行透明化处理，使CAR
‑
T荧光可以穿透微球被精确检测到；4)使用高内涵共聚焦断层扫描方式，获得微球不同层面的CAR
‑
T浸润信息；5)建立对核心层面的分析方法，去除球体表面结合CAR
‑
T的干扰，分析内部不同范围CAR
‑
T荧光强度，更准确地评估肿瘤微球内部浸润CAR
‑
T细胞的水平。2.根据权利要求1所述的一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为CAR
‑
T的靶细胞。3.根据权利要求1或2所述的一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为过表达荧光蛋白或/和靶抗原或内源性表达靶抗原的细胞系。4.根据权利要求3所述的一种用3D模型检测CAR
‑
T细胞在实体瘤中浸润的方法，其特征在于，所述靶抗原或内源性表达靶抗原的细胞系为BxPc
‑
3、NCI
‑
N87、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭彬彬，张瑾，张静，郑勇，顾继杰，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：