一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株及其构建与应用制造技术

本发明专利技术涉及一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株及其构建与应用。所述变形假单胞菌fliP基因回补菌株的分类命名为Pseudomonas plecoglossicidaC

【技术实现步骤摘要】
一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株及其构建与应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株C
‑
ΔfliP及其构建与应用。

技术介绍

[0002]变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)隶属于变形菌门、γ
‑
变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科、假单胞菌属、恶臭假单胞菌组。变形假单胞菌是一种革兰氏阴性杆状菌，具有极性鞭毛，能运动。最早在淡水养殖的患细菌性出血腹水病的香鱼中分离鉴定到的。近年来，也有关于海水鱼类感染该菌的报道，如变形假单胞菌感染的虹鳟则会出现肝脏出血和肿胀，肠道中则出现微黄色液体，而感染大黄鱼和石斑鱼后则会引起“内脏白点病”。“内脏白点病”病原菌感染高峰期在每年秋冬降温期，发病高峰期在次年春季升温期，具有流行区域广、感染性强、死亡率高、潜伏期较长等特点，其发病温度在15℃到20℃之间。
[0003]鞭毛是细菌主要的运动器官，与细菌致病性相关，如鞭毛可促进细菌的黏附和趋化，以及生物膜的形成。此外细菌鞭毛分泌系统能够分泌一些毒力相关蛋白。鞭毛结构精密而复杂，其组装过程高度有序，遵循逐级调控模式。在组装细菌鞭毛的过程中，形成鞭毛外部结构的蛋白质亚基由存在于鞭毛内膜部分的分泌装置输出到胞外，最后组装成完整的鞭毛结构，这种装置被称为鞭毛Ⅲ型分泌系统（type III secretion，T3SS），与细菌Ⅲ型分泌系统同源。鞭毛T3SS 由6个膜内蛋白 (FliO、FliP、FliQ、FliR、FlhA、FlhB) 和3个胞质ATP酶蛋白复合体 (FliI、FliH、FliJ) 组成。其中，FliP在FliO的帮助下形成直径为10 nm的三聚体
‑
二聚体结构，随后是与FliQ、FliR、FlhB及FlhA结合，形成鞭毛T3SS。FliP蛋白由fliP基因编码，fliP基因是细菌众多鞭毛基因中的一个，参与形成鞭毛T3SS，在鞭毛组装过程中发挥重要作用。研究发现，敲除fliP基因会导致细菌鞭毛缺失，影响细菌的运动能力。
[0004]本专利技术在变形假单胞菌fliP基因敲除菌株的基础上构建了一株fliP基因回补菌株C
‑
ΔfliP。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株及其构建与应用，以揭示fliP基因对变形假单胞菌生物学特性，并明确该变形假单胞菌fliP基因回补菌株的应用范围。
[0006]本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株，所述菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicidaC
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Δ fliP，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221619，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
[0007]上述一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建方法，其是将fliP基因与表达载体pCM130/tac连接，得到重组回补质粒pCM130/tac
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C
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fliP；将重组回补质粒pCM130/tac
‑
C
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fliP电击转化至变形假单胞菌fliP基因敲除菌株内，启动fliP基因重新表达，即完成所
述变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建；其中，所述变形假单胞菌fliP基因敲除菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida Δ fliP，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221617，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
[0008]其中，所述fliP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]其中，所述构建方法具体为：设计引物P7/P8用于扩增fliP基因；将fliP基因与质粒pCM130/tac连接，构建得到重组回补载体pCM130/tac
‑
fliP；通过电击转化的方式将重组回补载体pCM130/tac
‑
fliP导入变形假单胞菌fliP基因敲除菌株感受态细胞内，涂布在含10 μg/mL四环素的LB琼脂平板中培养至单克隆长出，再使用引物P5/P6进行PCR扩增鉴定，最终获得所述变形假单胞菌fliP基因回补菌株。
[0010]其中，所述引物P7/P8序列如下：P7：5
’‑
CGGTGTACAAACATCAGGAACCTCCGAAGG
‑3’
，P8：5
’‑
TGCATGCATATGAACATCAAACGTTGGCCG
‑3’
。
[0011]其中，所述引物P5/P6以变形假单胞菌fliP基因回补菌株C
‑
ΔfliP菌液为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳得到768 bp和86 bp的条带；所述引物P5/P6序列如下：P5：5
’‑
TCAGGAACCTCCGAAGGGCT
‑3’
，P6：5
’‑
ATGAACATCAAACGTTGGCCG
‑3’
。
[0012]上述一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株在研究变形假单胞菌fliP基因的功能中的应用。
[0013]上述一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株在研究变形假单胞菌致病机理中的应用。
[0014]本专利技术的显著优点在于：本专利技术在变形假单胞菌fliP基因敲除菌株的基础上构建了一株fliP基因回补菌株，通过构建变形假单胞菌fliP基因回补菌株可更为准确地研究fliP基因对变形假单胞菌生物学特性的影响。
附图说明
[0015]图1：变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建。（A）：fliP基因全长PCR扩增，M：DL 1000 marker；1：fliP基因片段。（B）：重组回补质粒pCM130/tac
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fliP酶切，M：DL5000 marker；1：pCM130/tac
‑
fliP单酶切条带；2：pCM130/tac
‑
fliP双酶切条带。（C）：回补菌株C
‑
ΔfliP的PCR鉴定，M：DL 1000 marker；1：fliP基因片段。
[0016]图2：变形假单胞菌敲除菌株ΔfliP和回补菌株C
‑
ΔfliP目的基因fliP表达的检测。（A）：敲除菌株ΔfliP和回补菌株C
‑
ΔfliP的RT
‑
PCR检测，M：DL 1000 marker；1
‑
3：野生株；4
‑
6：敲除菌株；7
‑
9：回补菌株，10：空白对照。（B）：敲除菌株ΔfliP和回补菌株C
‑
ΔfliP的qRT
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株变形假单胞菌fliP基因回补菌株，其特征在于：所述菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida C
‑
Δ fliP，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221619，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。2.一种如权利要求1所述的变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建方法，其特征在于：将fliP基因与表达载体pCM130/tac连接，得到重组回补质粒pCM130/tac
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C
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fliP；将重组回补质粒pCM130/tac
‑
C
‑
fliP电击转化至变形假单胞菌fliP基因敲除菌株内，启动fliP基因重新表达，即完成所述变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建；其中，所述变形假单胞菌fliP基因敲除菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida Δ fliP，已于2022年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221617，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。3.根据权利要求2所述的变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建方法，其特征在于：所述fliP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的变形假单胞菌fliP基因回补菌株的构建方法，其特征在于：设计引物P7/P8用于扩增fliP基因；将fliP基因与质粒pCM130/tac连接，构建得到重组回补载体pCM130/tac

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玲敏，何丽，鄢庆枇，覃映雪，杨豆，石涟，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：