一种生产5-羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种生产5

【技术实现步骤摘要】
一种生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物技术生产领域，尤其是一种生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
‑5‑
hydroxytryptophan(5
‑
HTP)是一种非蛋白质氨基酸，是多种重要生理功能分子的前体，例如神经递质血清素(又称5
‑
hydroxytryptamine，5
‑
HT)和激素褪黑素等。5
‑
HTP已被证明在治疗抑郁症、失眠、帕金森综合征和阿尔兹海默症等诸多疾病方面具有显著疗效，这也使其在医药、保健品等领域的应用不断得到扩展，商业潜力得到持续挖掘。
[0003]目前，商业上的主流5
‑
HTP生产方法仍然是植物种子提取法。然而，该法所使用的原材料Griffonia Simplifolia种子需要从非洲进口，这在很大程度限制了产能的扩增，导致5
‑
HTP市场价格居高不下。此外，化学法虽也有研究，但因其复杂的过程、高昂的底物成本等因素，导致其在经济上并不可行。可见，传统生产方法已经不能满足日益增长的市场需求，因此需要一种更实用的方法来提供更高更稳定的产能。而微生物发酵作为一种高效、低成本、可持续且环境友好的生产技术，已被应用到许多有价值天然分子的大规模工业化生产中，无疑是生产5
‑
HTP更可行的选择。
[0004]近年来，经过研究者们的不懈努力，5
‑
HTP微生物细胞工厂的开发取得了从无到有的突破。但是，高效5
‑
HTP工程菌的构建仍然面临着诸多瓶颈，如异源羟化酶在原核底盘细胞中的低活性和低可溶性，以及前体物L
‑
Trp的大量盈余等，这些问题导致现有的生产菌株均难以满足实际生产应用的要求。而考虑到大规模5
‑
HTP生产的经济可行性，构建能够稳定地获得高效价、高纯度5
‑
HTP，且低L
‑
Trp残留的高效微生物细胞工厂尤为关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于提供上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法。
[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0009]一种生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌，命名为HTP12(为经人工改造的、具有特定基因型的大肠杆菌)，以5
‑
HTP工程菌株HTP10(CN113549588A)为基础，在工程菌HTP10基因组mbhA
‑
TPH150位点整合了一个由M1
‑
30启动子驱动的gdh
esi
基因；向其细胞中电转化入重组质粒pSTV
‑
TM2。
[0010]上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌通过引入异源羟化活性更高的色氨酸羟化酶突变体TM2，替代了原有的羟化酶突变体TPH150(提高工程菌株胞内羟化反应效率，构建更加高效的色氨酸羟化模块)；引入来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶
(GDH
esi
)途径，有效再生两种还原型辅因子NAD
+
和NADP
+
(间接强化了胞内色氨酸羟化反应，显著提高5
‑
HTP的产量，并降低中间体L
‑
Trp的盈余)。所述GDH
esi
和TM2基因均为经密码子优化后人工合成。
[0011]上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌于
‑
80℃冰箱保存即可。
[0012]优选的，上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 273250。
[0013]优选的，上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌，所述gdh
esi
基因(Exiguobacterdium sibiricum葡萄糖脱氢酶基因)具有SEQ ID No.4所示序列，编码来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶(GDH
esi
)。
[0014]优选的，上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌，所述M1
‑
30启动子为中等强度启动子，具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列。
[0015]优选的，上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌，所述重组质粒pSTV
‑
TM2，是以质粒pSTV28为载体构建得到的，所述质粒pSTV28具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，该pSTV28为中拷贝质粒，具有p150A复制起始位点(ori),所述重组质粒pSTV
‑
TM2携带有色氨酸羟化酶突变体TM2基因，TM2基因具有SEQ ID No.1所示序列，由T7启动子驱动表达，编码色氨酸羟化酶突变体TM2，所述T7启动子具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列。
[0016]上述色氨酸羟化酶突变体TM2衍生于人源2型色氨酸羟化酶TPH2(humanTPH2，EC:1.14.16.4)，具有SEQ ID No.1所示序列，是由人源2型色氨酸羟化酶TPH2删除了N端145个氨基酸和C端30个氨基酸，再将第2位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸，将第97位氨基酸由天冬酰胺突变为异亮氨酸，将第99位氨基酸由脯氨酸突变为半胱氨酸后得到的。
[0017]上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
[0018](1)为了构建NAD(P)H再生模块并敲除原有的TPH150基因，采用CRI SPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli HTP10基因组进行定向改造，将M1
‑
30启动子驱动的gdh
esi
基因整合于HTP10基因组的mbhA
‑
TPH150位点，得到菌株HTP11；
[0019](2)为了实现色氨酸羟化酶突变体基因TM2的高效表达，利用II One Step Cloning Kit试剂盒，以中拷贝质粒pSTV28作为线性载体，克隆由T7启动子引导表达的TM2基因，构建质粒pSTV
‑
TM2，并将其电转入工程菌HTP11中，最终得到菌株HTP12。
[0020]上述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌在发酵产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌，其特征在于：命名为HTP12，以5
‑
HTP工程菌株HTP10为基础，在工程菌HTP10基因组mbhA
‑
TPH150位点整合了一个由M1
‑
30启动子驱动的gdh
esi
基因；向其细胞中电转化入重组质粒pSTV
‑
TM2。2.根据权利要求1所述的生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 273250。3.根据权利要求1所述的生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述gdh
esi
基因具有SEQ ID No.4所示序列，编码来源于Exiguobacterdium sibiricum的葡萄糖脱氢酶。4.根据权利要求1所述的生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述M1
‑
30启动子为中等强度启动子，具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌HTP10，其特征在于：所述重组质粒pSTV
‑
TM2，是以质粒pSTV28为载体构建得到的，所述质粒pSTV28具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，该pSTV28为中拷贝质粒，具有p150A复制起始位点,所述重组质粒pSTV
‑
TM2携带有色氨酸羟化酶突变体TM2基因，TM2基因具有SEQ ID No.1所示序列，由T7启动子驱动表达，编码色氨酸羟化酶突变体TM2，所述T7启动子具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列。6.权利要求1所述生产5
‑
羟基色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)为了构建NAD(P)H再生模块并敲除原有的TPH150基因，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli HTP10基因组进行定向改造，将M1
‑
30启动子驱动的gdh
esi
基因整合于HTP10基因组的mbhA

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，张震，余子辰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：