植物弱毒突变体及其在生产外源蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物弱毒突变体及其在生产外源蛋白中的应用，属于生物技术领域。所述弱毒突变体是将小西葫芦黄花叶病毒辅助成分

【技术实现步骤摘要】
植物弱毒突变体及其在生产外源蛋白中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种植物弱毒突变体及其在生产外源蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效表达。由于植物易于栽培和管理，并且植物病毒不会感染家畜和人类，使用安全，因此以工厂化形式生产植物为载体的工业蛋白和医药蛋白的研究，受到世界上很多国家的重视。植物病毒病一直危害着各类农业的生产，植物病毒进入植株体内在短时间内会大量积累，对植株的生长发育造成影响，最近几年，将植物病毒改造为植物病毒表达载体受到广泛关注。植物病毒表达载体具有表达水平高、增殖速度快、易于遗传操作、宿主范围广和外源蛋白易于纯化和保存等优点，使它在应用方面非常受欢迎。尤其在植物体内表达口服疫苗和药用蛋白，与其他生产口服疫苗和药用蛋白的方法相比较，可大大降低成本且服用方便，这些优点使植物有可能成为生产外源蛋白的最大生物反应器。然而我国对于植物病毒表达载体的研究进展缓慢，目前已有的植物病毒表达载体存在不能移动或者致死的缺点、仍缺乏安全高效的植物病毒表达载体。
[0003]小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是马铃薯Y病毒属的重要成员，主要侵染葫芦科作物。ZYMV辅助成分
‑
蛋白酶(HC
‑
Pro)的某些位点的氨基酸突变后，病毒的致病力显著下降。因此，突变体ZYMV突变体具有改造为安全高效的植物病毒表达载体的潜力。
[0004]乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)是人体肝脏内乙醇代谢的关键酶，共同构成了ADH氧化体系。乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶在食品科学和医药研究上的应用十分广泛，所以市场上对乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶的需求很大。目前主要是从动物的肝脏中获取这两种酶，但受到原材料的严重限制，使其生产成本较高。若利用微生物外源表达ADH和ALDH，但由于蛋白很难有效形成正确折叠，导致表达的蛋白活性较低。因此，开发新的ADH和ALDH生产方式是目前所面临的技术难点。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种植物弱毒突变体及其在生产外源蛋白中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体，所述弱毒突变体是将小西葫芦黄花叶病毒辅助成分
‑
蛋白酶(HC
‑
Pro)的第182位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸；突变后的HC
‑
Pro的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第二方面，提供上述小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体在表达外源蛋白中的应用。
[0009]上述应用中，所述外源蛋白为乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶。
[0010]本专利技术的第三方面，提供一种利用植物弱毒突变体表达外源蛋白的方法，包括以下步骤：
[0011](1)将表达外源蛋白的基因片段插入到小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体中，获得弱毒突变体植物病毒表达载体；
[0012](2)将弱毒突变体植物病毒表达载体转化农杆菌，获得重组菌；利用重组菌侵染植物，侵染后10
‑
30d，收集植物的叶片，并进行外源蛋白的提取和纯化。
[0013]优选的，步骤(1)中，所述基因片段为含有ADH基因或者ALDH2基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。
[0014]优选的，步骤(2)中，所述植物为黄瓜，在黄瓜植株第一片真叶完全展开时浸润两片子叶及部分真叶。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016](1)本专利技术的小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体，其致病力显著下降；但在植物体内的病毒积累量与野生型没有明显区别，适合作为植物病毒表达载体。
[0017](2)利用本专利技术的小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体可以高效生产乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)。
附图说明
[0018]图1：ZYMV
K182R
表达载体基因组结构示意图。
[0019]图2：ZYMV
K182R
‑
ADH在植物中表达外源蛋白的应用效果图。
[0020]图3：ZYMV
K182R
‑
ALDH2在植物中表达外源蛋白的应用效果图。
具体实施方式
[0021]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0022]如前所述，利用植物病毒表达载体表达外源蛋白具有诸多的优势，但目前仍缺乏安全高效的植物病毒表达载体。乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)是人体肝脏内乙醇代谢的关键酶，市场需求量较大，但目前缺少有效的外源表达方式。
[0023]基于此，本专利技术对利用植物病毒表达载体生产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶进行了深入研究。
[0024]小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)寄主范围较广，具有开发成为植物病毒表达载体的基础，由此，本专利技术以ZYMV作为研究对象，开发设计了ZYMV的弱毒突变体。研究表明HC
‑
Pro基因突变可改变ZYMV侵染所引发的症状，目前虽也有关于将ZYMV的HC
‑
Pro进行突变以改变其侵染能力的报道，但是，HC
‑
Pro突变的位置以及突变后所带来的功能改变都是不可预期的；而且，利用ZYMV的弱毒突变体作为植物病毒表达载体生产外源蛋白，弱毒性仅是其性能要求之一，若获得较优的外源蛋白表达效果，ZYMV的弱毒突变体接种后在植物体内的病毒积累量也是需要重点关注的性能。
[0025]基于上述性能考虑，本专利技术通过大量试验发现：将小西葫芦黄花叶病毒辅助成分
‑
蛋白酶(HC
‑
Pro)的第182位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸，一方面其致病力显著下降；另一方
面，病毒的积累量相较于野生型没有明显区别。因此，ZYMV弱毒突变体ZYMV
K182R
适合作为生产外源蛋白的植物病毒表达载体。
[0026]小西葫芦黄花叶病毒辅助成分
‑
蛋白酶(HC
‑
Pro)突变前的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
[0027][0028]小西葫芦黄花叶病毒辅助成分
‑
蛋白酶(HC
‑
Pro)突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
[0029][0030]在ZYMV弱毒突变体ZYMV
K182R
中嵌入ADH和ALDH2等基因片段，将其转入植物中进行外源蛋白的表达，结果发现，利用表达载体可以在植株中高效表达ADH、ALD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体，其特征在于，所述弱毒突变体是将小西葫芦黄花叶病毒辅助成分
‑
蛋白酶的第182位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸。2.权利要求1所述的小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体在表达外源蛋白中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白为乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶。4.一种利用植物弱毒突变体表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将表达外源蛋白的基因片段插入到小西葫芦黄花叶病毒的弱毒突变体中，获得弱毒突变体植物病毒表达载体；(2)将弱毒突变体植物病毒表达载体转化农杆菌，获得重组菌；利用重组菌侵染植物，侵染后10
‑
30d，收集植物的叶片，并进行外源蛋白的提取和纯化。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，郭玉斌，田延平，耿超，闫志勇，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：