一种重组腺相关病毒的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种重组腺相关病毒的制备方法和应用。所述重组腺相关病毒的制备方法包括以下步骤：S1：重组腺相关病毒血清型包装质粒的构建。S2：重组腺相关病毒的制备。本发明专利技术主要构建了重组腺相关病毒rAAV

【技术实现步骤摘要】
polyA、所述腺病毒元件辅助质粒为pAd
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Helper。
[0013]进一步地，S2中所述装载核心元件的质粒pAAV
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hSyn
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H2B
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mCherry
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WPRE
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hGH polyA、所述腺病毒元件辅助质粒pAd
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Helper和所述质粒pAAV2/F按质粒分子数1:1:1共转染HEK
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293T细胞，所述重组腺相关病毒为rAAV2/F
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hSyn
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H2B
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mCherry
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WPRE
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hGH polyA。
[0014]进一步地，S2中所述HEK
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293T细胞转染72小时后进行收集和提取处理。
[0015]进一步地，S2中收集和提取处理过程包括粗提纯：
[0016]所述HEK
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293T细胞沉淀经裂解液重悬，于液氮和37℃水浴反复冻融后加入Benzonase核酸酶和NaCl摇床处理30min，取细胞上清液；所述细胞上清液经核酸酶处理后，加入PEG8000和NaCl溶液混匀后于4℃放置16h聚沉蛋白；次日将处理过的所述细胞上清液4℃10000g离心30min弃上清，然后将细胞样品与沉淀物合并离心10，弃细胞碎片沉淀，得到粗纯液。
[0017]进一步地，S2中收集和提取处理过程包括再提纯：
[0018]于离心管中依次加入浓度为15％、25％、40％、58％的碘克沙醇溶液形成密度梯度，后加入10mL所述粗纯液，最后用PBS补满所述离心管并封口，置于离心机在18℃条件下64000rpm离心2小时；离心结束后用注射器吸取40％与58％碘克沙醇分离层的溶液，置于透析袋中，4℃条件下在PBS缓冲液里透析16h；透析后的所述粗纯液用0.22μm的滤膜过滤除菌后加至超滤管中，离心脱盐浓缩至体积200μL左右，然后加入终浓度为0.001％的Pluronic F68，分装后储存于
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80℃冰箱中。
[0019]本专利技术的一个目的是提供如以上任一项所述的重组腺相关病毒的制备方法在神经元逆行标记或神经环路示踪病毒中的应用。
[0020]本专利技术主要构建了重组腺相关病毒rAAV
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F的包装质粒，并基于三质粒转染系统生产重组腺相关病毒，能够高效快速获得高滴度的重组腺相关病毒rAAV
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F，所获得的rAAV
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F可以高效逆行标记神经网络，为神经环路示踪提供新的的工具载体，为疾病模型建立和基因治疗等提供了更好的工具和技术支撑，具有广泛的应用价值和光明的市场前景。
附图说明
[0021]图1为重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV2/F表达载体图谱；
[0022]图2为rAAV2/F感染注射位点SSP脑区的信号和逆行感染的上游脑区对侧皮层的信号；
[0023]图3为rAAV2/F逆行感染的上游脑区丘脑的信号。
具体实施方式
[0024]为了使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本专利技术的可实施范围的限定。
[0025]一、重组腺相关病毒血清型包装质粒的构建
[0026]以质粒pAAV2/9为起始模板，基于点突变的原理，使用Fast Mutagenesis System(全式金公司)试剂盒PCR反应构建并扩增质粒pAAV2/F。正向引物CapF
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F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物CapF
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R的序列如SEQ ID NO.2所示；PCR的反应体系均为50μL：2
×
FastPfuFly PCR SuperMix 25μl，10μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，模板
DNA 2μl，ddH2O 31μl。扩增方法为：98℃5min，98℃30s，60℃30s，72℃5min，72℃10min，16℃30min，36个循环。PCR扩增产物需添加1μL模板消化酶DMT(全式金公司)，37℃消化模板1小时。消化后的产物取5μL用来转化感受态大肠杆菌Stbl3，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落活化并接种到15毫升LB液体培养基中进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pAAV2/F，获得质粒能够编码AAVF衣壳蛋白VP1。构建获得的重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV2/F表达载体的图谱如图1所示，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。本专利技术所有PCR使用引物、基因合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0027]二、重组腺相关病毒的制备
[0028]利用重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV2/F表达载体包装重组腺相关病毒，将装载核心元件的质粒pAAV
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hSyn
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H2B
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mCherry
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WPRE
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hGH polyA与pAAV2/F质粒、腺病毒元件辅助质粒pAd
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Helper按质粒分子数1：1：1共转染HEK
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293T细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀并分别处理：含有AAV病毒粒子的HEK
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293T细胞沉淀经裂解液(15皿细胞量加9mL)重悬，于液氮和37℃水浴反复冻融后加入Benzonase核酸酶(Sigma，E1014
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25KU)37℃消化1小时，后加终浓度150mM NaCl 37℃摇床处理30min；细胞上清液经核酸酶处理后，加入PEG8000(索莱宝，214B0310)和0.5mol/L的NaCl溶液混匀后于4℃放置16h聚沉蛋白。次日将处理过的上清液4℃10000g离心30min弃上清，然后将细胞样品与上清液沉淀样品合并，3000g离心10min，弃细胞碎片沉淀，得到病毒粗纯液。于贝克曼超速离心管中依次加入浓度为15％、25％、40％、58％的碘克沙醇溶液形成密度梯度，后加入10mL粗纯病毒液，最后用PBS补满离心管并封口。配平后置于Ti70转子经贝克曼超速离心机在18℃条件下64000rpm离心2小时。离心结束后用注射器吸取以回收40％与58％碘克沙醇分离层的溶液。将吸取的含rAAV的碘克沙醇层溶液置于透析袋中，4℃条件下在PBS缓冲液里透析16h；透析后的病毒液用0.22μm的滤膜过滤除菌后加至超滤管(Minipore，UFC910024)中，离心脱盐浓缩至体积200μL左右，然后加入终浓度为0.001％的Pluronic F68(Thermo Fisher Scientific，24040032)，分装后储存于
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80℃冰箱中。最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV2/F
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hSyn
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：重组腺相关病毒血清型包装质粒的构建：以质粒pAAV2/9为模板，序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段为正向引物，序列号如SEQ ID NO.2所示的基因片段为反向引物，采用PCR扩增，获得pAAV2/F质粒，所述pAAV2/F质粒的序列如SEQ ID NO：3所示；S2：重组腺相关病毒的制备：将装载核心元件的质粒、腺病毒元件辅助质粒和所述pAAV2/F质粒共转染HEK
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293T细胞，包装后获得所述重组腺相关病毒。2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S1中PCR扩增体系体积为50μL，包括2
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FastPfuFly PCR SuperMix 25μL，10μM所述正向引物1μL，10μM所述反向引物1μL，所述质粒pAAV2/9 2μL，ddH2O 31μL。3.如权利要求1所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，PCR扩增方法为：98℃5min，98℃30s，60℃30s，72℃5min，72℃10min，16℃30min，36个循环。4.如权利要求1所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S1中扩增产物经去甲基化酶处理转化感受态Stbl3大肠杆菌，包括以下步骤：所述扩增产物需添加1μL模板消化酶DMT，37℃消化1小时；消化后的所述扩增产物取5μL用来转化感受态大肠杆菌Stbl3，菌落PCR鉴定为阳性的单菌落活化并接种到15mL LB液体培养基中进行培养并抽提质粒进行测序。5.如权利要求1所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S2中所述装载核心元件的质粒为pAAV
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hSyn
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H2B
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mCherry
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WPRE
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hGH polyA、所述腺病毒元件辅助质粒为pAd
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Helper。6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S2中所述装载核心元件的质粒pAAV
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【专利技术属性】
技术研发人员：骆能松，林坤章，韩增鹏，徐富强，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：