一种诱导脐带间充质干细胞分化并生产细胞因子的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导脐带间充质干细胞分化并生产细胞因子的方法。本发明专利技术制备获得了特异性的抑制Wnt1/β

【技术实现步骤摘要】
一种诱导脐带间充质干细胞分化并生产细胞因子的方法


[0001]本申请涉及生物领域，更具体的涉及一种诱导脐带间充质干细胞分化并生产细胞因子的方法。

技术介绍

[0002]细胞因子是一大类对细胞间信号传递很重要的蛋白质。它们由多种细胞产生，包括干细胞，免疫细胞，如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。细胞因子的释放将对周围细胞活动产生影响。细胞因子可包括白细胞介素、干扰素、生长因子、肿瘤坏死因子、趋化因子和集落刺激因子。
[0003]白细胞介素(Interleukins)又简称为ILs，是一种细胞因子，在调控细胞进程(细胞生长、分化和移动)和刺激免疫反应方面起着重要作用。最初是在白细胞中发现，目前发现它们可由许多种细胞产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞等具有实体结构和功能的细胞。主要包括CXCL8，IFNL3，IL10，IL11，IL12，IL12A，IL13，IL15，IL15RA，IL16，IL17A，IL17B，IL17F，IL17RA，IL18，IL19，IL1A，IL1B，IL1RL2，IL1RN，IL2，IL20，IL20RA，IL21，IL22，IL23，IL23R，IL3，IL31，IL33，IL36A，IL36B，IL36G，IL36RN，IL37，IL4，IL4R，IL5，IL6，IL7，IL9等。干扰素(Interferon)简称IFN，是宿主细胞针对多种存在的病毒制造并释放出一组信号蛋白，因其能保护细胞免受病毒感染，“干扰”病毒复制而得名。干扰素属于一大类细胞因子的蛋白质，用于细胞之间沟通，以触发免疫系统的保护性防御，来消灭病原体。生长因子也属于一种蛋白质或是类固醇激素，为天然存在物，能刺激细胞的生长、分化、生存、炎症和组织修复。生长因子对调节不同的细胞进程有重要的作用，可由邻近细胞、远处组织和腺体，甚至肿瘤细胞本身分泌。正常细胞通过表现出对几种生长因子的需求，来维持增殖和生存能力。生长因子可通过内分泌、旁分泌或自分泌机制发挥其刺激作用。
[0004]目前细胞因子的生产方法有很多种。比如CN106520689A提供了一种间充质干细胞细胞因子的制备方法，包括以下步骤：提取间充质干细胞；培养；低氧条件下继续培养；用0.25％胰酶EDTA溶液消化；离心，用0.9％生理盐水清洗；用0.9％生理盐水调整细胞浓度，再添加1 3mg/mL的EDTA和5 10mg/mL的Vc；冻融；离心，过滤。但是所述方法针对细胞因子IL
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6的产量并不高。
[0005]CN106367389A中公开了一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，其细胞因子主要是通过将培养瓶中P20代内的细胞进行离心、孵化、二次离心和超滤浓缩后得到因子浓缩液来制备的，同样的其获得的细胞因子中并不高表达IL
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6。CN105543313A中公开了一种分离纯化人源间充质干细胞因子的方法，它包括细胞培养上清液的获取：取人间充质干细胞，置于间充质干细胞无血清培养基中培养，当细胞生长到汇合度75～85％时，收集上清液，过滤浓缩：对上清液先采用0.22μm滤膜过滤；然后通过50KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过1KD超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可。所述方法同样的在制备过程中IL
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6的生产较少。
[0006]由于白介素6(interleukin 6，IL
‑
6)，是与炎症相关最为典型的细胞因子。它通过调节免疫和炎症反应，在宿主防御中发挥着重要作用。IL
‑
6是一个小分子糖蛋白，分子量为19
‑
28kDa，由184个氨基酸形成四个α螺旋结构，通常以单体形式存在，等电点为5.0。编码人IL
‑
6的基因位于染色体7p15
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21，包括4个内含子和5个外显子。IL
‑
6有3个受体结合位点，包括1个特异性受体IL
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6R(IL
‑
6binding receptor protein，IL
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6R)结合位点，和2个gp130(signal
‑
transducing protein)结合位点。IL
‑
6也是一种具有多效活性的细胞因子，可以促进多种细胞的增殖和分化，也可以加速肝细胞急性期蛋白的合成，还可以抑制M1髓性白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化，抑制黑素瘤、乳腺癌细胞的生长。因此，高效生产IL
‑
6细胞因子是目前研究的迫切方向。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种高效生产IL
‑
6及其他细胞因子的方法。
[0008]具体的，本专利技术提供一种生产含有IL
‑
6细胞因子的细胞因子混合物的方法。
[0009]Wnt
‑
1蛋白是由343个氨基酸组成分泌型糖蛋白，多数通过细胞表面Frizzled家族受体发挥作用，在胚胎正常发育过程中是必不可少。Wnt
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1的激活会引起复杂的级联信号反应，最终导致多个基因表达上调。Wnt
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1参与了人体多种细胞进程，并影响某些系统的正常功能。Wnt1/β
‑
catenin通路中Wnt
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1是最重要的调控蛋白。通过抑制Wnt
‑
1的活性，能够整体上抑制Wnt1/β
‑
catenin通路。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体。
[0011]所述抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体是Wnt
‑1‑
13F，轻链可变区VL氨基酸序列：
[0012]QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCNTEYRGARGSWYQQKPGSSPKPWIYPWEHQTHGVPFRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCIASYMILFLFGGGTKLEIK
[0013]重链可变区VH氨基酸序列：
[0014]QVKLQESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFYFIPYPWVRQAPGKGLEWVAVTTVIMWDGPDEWDENLCRRFTISRDDSQSMLYLQMHNLKTDDTAMYYCVRITESAWAIVEFAFWGAGTTVTVSS
[0015]所述抗体的轻重链可变区分别是：
[0016]LCDR1NTEYRGARGSLCDR2PWEHQTHLCDR3IASYMILFLHCDR1FIPYPHCDR2VTTVIMWDGPDEWDENLCRHCDR3ITESAWAIVEFAF
[0017]进一步的，本专利技术还提供了抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体在制备促进脐带间充质干细胞分化为肝样细胞的试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体是Wnt
‑1‑
13F，其轻链可变区VL氨基酸序列：所述抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体是Wnt
‑1‑
13F，轻链可变区VL氨基酸序列：QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCNTEYRGARGSWYQQKPGSSPKPWIYPWEHQTHGVPFRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCIASYMILFLFGGGTKLEIK重链可变区VH氨基酸序列：QVKLQESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFYFIPYPWVRQAPGKGLEWVAVTTVIMWDGPDEWDENLCRRFTISRDDSQSMLYLQMHNLKTDDTAMYYCVRITESAWAIVEFAFWGAGTTVTVSS。2.权利要求1所述的单克隆抗体Wnt
‑1‑
13F在制备通过抑制Wnt1/β
‑
catenin通路活性进而用于抑制Wnt1/β
‑
catenin通路活性的药物中的用途。3.权利要求1所述的抑制Wnt
‑
1的活性的单克隆抗体Wnt
‑1‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张化杰，王振，
申请(专利权)人：北京绎源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：