一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用。其中以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，该全人源拮抗抗体为单链抗体，其氨基酸序列为SEQIDNO:3所示。本发明专利技术通过类风湿关节炎患者ScFv噬菌体抗体库，筛选出全人源抗CTGF单克隆抗体，并分别测定其核苷酸序列和氨基酸序列，通过该方法获得的全人源拮抗抗体具有靶向人结缔组织生长因子的特异性。子的特异性。子的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用
[0001]本申请为申请号202011159590.4、申请日2020年10月27日，专利技术名称“一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体及其应用。

技术介绍

[0003]类风湿关节炎是一种病因复杂且反复发作的自身免疫性疾病，其病理特征表现为关节滑膜慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和纤维化，给广大患者造成了极大的不便及痛苦。由于其病因尚未完全明确，发病机制涉及到遗传、环境、免疫等多个方面，故而现行药物难以根治患者，仅仅只能做到对症治疗，即减轻或消除患者因关节炎症造成的关节红肿疼痛，控制疾病的发展，减少关节破坏，尽可能保证受累关节的功能。
[0004]国内外治疗类风湿关节炎的药物常用包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、改善病情抗风湿药（DMARDs）、生物制剂、中药及中药制剂等。其中抗体类生物制剂常以TNF
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α、IL
‑
1、IL
‑
6等作为靶点。由于这些蛋白在维持机体正常免疫功能方面发挥着重要的作用，故而采用其抑制剂作为药物进行治疗的不良反应较为显著。从人组合抗体库中采用噬菌体展示等技术能筛选出以细胞膜受体之天然配体为靶点的抑制剂或激活剂，这些抑制剂或激活剂的化学本质是抗体。不仅结构稳定（避免药物在到达病灶前，在体内被提前降解），且靶向性良好（可大大减少毒副作用），更为重要的是：这样产生的抗体能够克服杂交瘤技术生产抗体易引起排异反应、制备过程复杂、融合效率不高、抗体产量低、抗体不稳定、穿透力弱的缺点，还能实现高通量、快速筛选抗体的目的，且价格低廉。
[0005]人结缔组织生长因子是当前发现的与类风湿关节炎发病以及病程进展密切相关的蛋白，但至今未见从人组合抗体库中采用噬菌体展示等技术筛选以人结缔组织生长因子为靶点的抑制剂抗体的文献和产品。相比现有治疗类风湿关节炎的抗体类药物，人结缔组织生长因子为靶点的抗体类抑制剂药物还处于年轻的上升阶段，有很大的开拓空间。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种本专利技术提供了抗人结缔组织生长因子全人源单克隆单链抗体ScFv，利用基因工程的方法，在类风湿关节炎患者全人源噬菌体抗体库中淘选并鉴定出人结缔组织生长因子全人源单链抗体scFv，其特异性结合人结缔组织生长因子。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，该全人源拮抗抗体为单链抗体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示。
[0008]编码如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体的基因。
[0009]所述基因的核苷酸序列分别为SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19或SEQIDNO:20，分别对应氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10的全人源拮抗抗体。
[0010]一种含有如上述的基因的表达载体。这些表达载体可以选自质粒或病毒。
[0011]一种含有如上述的表达载体的重组细胞。这些重组细胞可以为真核细胞或原核细胞。
[0012]一种如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体的酶解片段，所述酶解片段为Fab、Fab
′
、F(ab
′
)2或Fv片段。
[0013]一种如上述的酶解片段的编码基因。
[0014]如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体在制备靶向人结缔组织生长因子的抑制剂的应用。
[0015]如上述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体在制备制备治疗或缓解类风湿关节炎的药物的应用。
[0016]本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过类风湿关节炎患者ScFv噬菌体抗体库，筛选出全人源抗CTGF单克隆抗体，并分别测定其核苷酸序列和氨基酸序列，通过该方法获得的全人源拮抗抗体具有靶向人结缔组织生长因子的特异性。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。
[0018]图1为PCR扩增轻链可变区Vκ基因；图2为PCR扩增重链可变区VH基因；图3为PCR扩增轻链可变区Vλ基因；图4为SOE
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PCR扩增scFv基因；图5为单克隆噬菌体ELISA检测中全人源抗体实验组的结果图；图6为具有靶向特异性的全人源拮抗抗体的重、轻链序列图；图7为CTGF拮抗抗体治疗CIA小鼠关节损伤及疾病进程对比。
具体实施方式
[0019]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。
[0020]本专利技术提供一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，为单链抗体，其具有靶向人结缔组织生长因子的特异性，其氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示。
[0021]本专利技术的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体可以与其他治疗类风湿关节炎的抗体类药物融合，所形成的抗体一方面可以发挥靶向人结缔组织生长因子的作用，另一方面可以起到治疗类风湿关节炎作用。
[0022]上述单链抗体的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。将编码上述单链抗体的DNA序列用PCR获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或基因片段。在编码上述抗体的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证抗体能够从细胞中分泌。载体序列中包括用于基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。
[0023]本专利技术的单链抗体可以与其他效应分子进一步融合，以达到其他额外的作用，而不影响其靶向性，它们都属于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体，其特征在于：该全人源拮抗抗体为单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。2.编码如权利要求1所述的以结缔组织生长因子为靶点的全人源拮抗抗体的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:13所示。4.一种含...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建光，吴淦，金胜威，杨新宇，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：