用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及了用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术还涉及上述试剂在制备检测试剂盒中的应用。本发明专利技术提供的致病基因MYPN和DSP新位点可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因MYPN和DSP开发的试剂及其检测试剂盒可以将携带MYPN c.3073dupC和DSP c.6751delT基因突变的患者和正常人群区分开，对扩张型心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。疗和预后均具有重要意义。疗和预后均具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用。

技术介绍

[0002]扩张型心肌病(diated cardiomyopathy,DCM)是引起心力衰竭(心衰)、心律失常和猝死的常见疾病之一，临床表现为：心脏逐渐扩大、心室收缩功能降低，心衰，室性和室上性心律失常，传导系统异常，血栓栓塞和猝死。2002年中国分层整群抽样调查9个地区8080例正常人群，DCM患病率为19/10万(王志民，2004)。2004年中国一项报道显示，767例DCM患者随访52个月病死率为42.24％(Liu X,2014)，给家庭和社会带来了沉重的负担。
[0003]由致病基因突变导致的DCM称为“家族性DCM(familial diated cardiomyopathy,FDCM)”，FDCM的主要致病基因有TTN、LMNA、MYH7、MYH6、MYPN、TNNT2、ACTC1、BAG3、DSP、RBM20、SCN5A、TPM1、DES和DMD，约40％的家族性DCM可筛查到明确的致病基因突变。其中，MYPN基因编码的蛋白质与骨骼肌或心肌中的伴肌动蛋白和α
‑
肌动蛋白相互作用。z线作为横纹肌的标志，代表肌动蛋白细丝、肌连蛋白、伴肌动蛋白或星云小体以及结构和功能所需辅助蛋白的末端。此外，该基因产物可以与I
‑
band蛋白相互作用，表明其具有调控和结构功能。DSP基因编码中间丝与染色体斑结合蛋白，结合产物形成功能性桥粒的专性组分。
[0004]基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，虽然目前已发现致病基因MYPN和DSP基因的许多突变位点，进一步发现新的MYPN和DSP基因突变将有助于进一步研究扩张型心肌病，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂及其应用。
[0006]本专利技术目的在于提供：用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列SEQ ID NO:9相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与所述生型MYPN基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10相比，所述致病基因MYPN编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型DSP基因的参考序列SEQ ID NO:11相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；与所述生型DSP基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO:12相比，所述致病基因DSP编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
[0007]具体突变信息如下：
[0008][0009]本专利技术还提供了用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。
[0010]本专利技术的原理和有益效果在于：本专利技术提供的致病基因MYPN和DSP新位点可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因MYPN和DSP开发扩张型心肌病体外诊断检测试剂盒可以将携带MYPN c.3073dupC、DSP c.6751delT基因突变的患者和正常人群区分开，对扩张型心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。为生育需求的患者提供为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，能够有效减少患儿的出生。
附图说明
[0011]图1为实施例1扩张型心肌病患者的Sanger测序图；
[0012]图2为实施例2扩张型心肌病患者的Sanger测序图；
[0013]图3为实施例3中携带MYPN c.3073dupC杂合错义变异的先证者的家系图；
[0014]图4为实施例3中携带DSP c.6751delT杂合错义变异的先证者的家系图。
具体实施方式
[0015]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0016]试剂来源：预混液：2
×
Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg
2+
、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase
‑
Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886
‑
01C。
[0017]实施例1：MYPN c.3073dupC验证实验
[0018]在临床诊断为扩张型心肌病患者(男，26岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5
‑
10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
[0019]S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。
[0020]S2、准备PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase
‑
Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：
[0021]正向引物(MYPN
‑
E14F，SEQ ID NO:5)：5'TTTCCTCACCCCAGACCCT 3'；反向引物
ID NO:8)：5'TTAGCACTTCAGACGCACT 3'。长度：614bp。扩增程序为：95℃预变性2min；93℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
[0033]将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型DSP基因序列(SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。
[0034]先证者携带了DSP基因c.6751delT纯合缺失变异(DSP:p.Phe2251LeufsTer33 hom)，测序结果如图2所示。该插入变异使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测扩张型心肌病致病基因新位点的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；所述致病基因为MYPN和DSP；与野生型MYPN基因的参考序列相比，所述致病基因MYPN的第3073位重复碱基C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第6751位缺失碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘哲，
申请(专利权)人：百世诺北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：