一种可用于疫苗生产的口蹄疫种毒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及疫苗制备领域，具体涉及一种可用于疫苗生产的口蹄疫种毒及其制备方法。本发明专利技术以BHK21贴壁细胞的扁瓶细胞或细胞工厂作为宿主，接入口蹄疫病毒及病毒培养液后进行培养，待细胞病变后收获贴壁种毒，而后将所述贴壁种毒接种于悬浮细胞中培养并获得悬浮种毒；其中，所述病毒培养液中含有HEPES和碳酸氢钠，pH值为7.70～7.85。采用本发明专利技术的方法能够高效制得口蹄疫种毒，且制得的口蹄疫种毒具有效价高、裂解少、可控性强等优势，在长期保存中具有较优的稳定性。较优的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于疫苗生产的口蹄疫种毒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及疫苗制备领域，具体涉及一种可用于疫苗生产的口蹄疫种毒及其制备方法。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot
‑
and
‑
mouth disease virus,FMDV)引起的,发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性疾病(口蹄疫)的病原。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。
[0003]疫苗接种是特异性预防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件，而口蹄疫病毒(FMDV)的制备对于相关疫苗的研发和生产具有重要意义。
[0004]当前，主流的生产FMDV的方法包括转瓶BHK21细胞培养法和BHK21细胞悬浮培养方法，其中，转瓶BHK21细胞培养方法在生产过程中需要较多的人工操作，容易散毒，较难完全控制生物安全；而悬浮培养法在生产过程中使用了大型生物反应器，能很好的保持生产过程生物安全，是目前疫苗的主要生产方式。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种可用于疫苗生产的口蹄疫种毒及其制备方法。
[0006]具体而言，本专利技术首先提供一种制备口蹄疫种毒的方法，包括：以BHK21贴壁细胞的扁瓶细胞或细胞工厂作为宿主，接入口蹄疫病毒及病毒培养液后进行培养，待细胞病变后收获贴壁种毒，而后将所述贴壁种毒接种于悬浮细胞中培养并获得悬浮种毒；
[0007]其中，所述病毒培养液中含有HEPES和碳酸氢钠，pH值为7.70～7.85。
[0008]本专利技术发现，上述方法获得的BHK21细胞长势良好，能高效制得口蹄疫种毒。其中，相较于现有技术中采用转瓶细胞对BHK21细胞进行贴壁培养的方式，采用本专利技术中的扁瓶细胞或细胞工厂培养时明显细胞长势更优，产毒后效价更高。同时，采用本专利技术的病毒培养液，能有效降低了口蹄疫种毒在培养过程中对BHK21细胞的不利影响。
[0009]作为优选，，所述病毒培养液按体积百分比计含有如下组分：1
‑
1.5％的1mol/L HEPES溶液、1.5
‑
2.2％的7.50％碳酸氢钠溶液、余量为0.5％乳依液。
[0010]作为优选，在接入口蹄疫病毒及病毒培养液时，先用病毒培养液对BHK21贴壁细胞进行涮洗，再按MOI为1:1～1:10进行接种。
[0011]作为一种优选的实施方式，在接入口蹄疫病毒及病毒培养液时，先用病毒培养液对BHK21贴壁细胞进行涮洗，再按MOI为1:1～1:10进行接种。
[0012]作为优选，待达到80～85％的病变比例后收获贴壁种毒。
[0013]作为优选，所述方法还包括：
[0014]将收获得到的贴壁种毒与灭菌的冷冻保护剂混合，而后对混合液进行检验冷冻；
[0015]所述冷冻保护剂包括甘油和卵白蛋白液，所述冷冻保护剂与所述贴壁种毒的体积比为0.8：1.2～1.5，所述卵白蛋白液占所述混合液总体积的0.8～1.2％。
[0016]本专利技术进一步发现，通过上述的灭菌的冷冻保护剂，能够在低温下对病毒进行有效保护。
[0017]作为优选，所述混合液的pH值为7.50
‑
7.60。在上述pH值下更有利于种毒的稳定保存。
[0018]作为一种优选的实施方式，通过7.50％碳酸氢钠溶液将所述混合液的pH值调控为7.50
‑
7.60。
[0019]作为优选，所述悬浮种毒的制备具体包括：
[0020]将沉降的BHK21悬浮细胞排上清换维持液复苏，将复苏细胞密度控制在6.0～8.0
×
106cells/ml，细胞活力在98.0％以上，启动搅拌、溶氧、温度自控，温度设定为36.5
‑
36.8℃，溶氧设定为35％
‑
40％，复苏0.3～0.5小时后启动pH自控设定为7.70
‑
7.85，按MOI为1:1～1:10接种所述贴壁种毒进行培养，待细胞病变后收获悬浮种毒。
[0021]本专利技术进一步发现，通过在上述参数下进行悬浮培养，生产的悬浮种毒效价更高。
[0022]在具体实施时，本领域人员可以根据细胞培养液的体积大小而设定相应的搅拌转速，在此不做特别限定。
[0023]作为优选，所述维持液中含有0.3～0.5％水解乳蛋白，且通过8～10％无水碳酸钠溶液调节pH值为7.70～7.85。
[0024]作为优选，当反应器DO下降率为0.2％/min以下时，开始对病毒液进行取样观察，破碎率大于90％时，开始收获悬浮种毒。
[0025]在具体实施时，本领域人员可以先将本专利技术制得的种毒放到
‑
20℃冰柜预冻后，再放入超低温环境中保存。
[0026]在具体实施时，本领域人员依据实际情况可以将种毒进行浓缩后保存。
[0027]本领域人员可依照常识对上述的优选方案进行组合，得到有关本专利技术中制备口蹄疫种毒的方法的较优实施例。
[0028]进一步的，本专利技术还提供一种口蹄疫种毒，其通过所述的制备口蹄疫种毒的方法制得。
[0029]进一步的，本专利技术还提供所述的制备口蹄疫种毒的方法或所述的口蹄疫种毒在疫苗生产中的应用。
[0030]本专利技术的有益效果如下：
[0031]采用本专利技术的方法能够高效制得口蹄疫种毒，且制得的口蹄疫种毒具有效价高、裂解少、可控性强等优势，在长期保存中具有较优的稳定性。
附图说明
[0032]图1为本专利技术实施例1中制备方法的流程示意图。
具体实施方式
[0033]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0034]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0035]实施例1
[0036]本实施例提供一种口蹄疫种毒，其通过如下的方法(流程示意图见图1)制得：
[0037]1、1mol/L HEPES配制：需用4mol/L的NaOH和2mol/LNaOH调PH值为8.00，使用一次性滤器过滤除菌。
[0038]2、病毒培养液配制：按体积百分比计，需添加1.5％的1mol/LHEPES溶液和1.8％的7.50％碳酸氢钠溶液到0.5％乳依液中。
[0039]3、扁平细胞或细胞工厂的检查：肉眼观察：细胞瓶壁发雾呈雪花状，花纹明显，贴壁均匀、溶液澄清。镜下观察：细胞呈长梭形或柳叶形，细胞间界限清楚，细胞整体排列规则致密，呈旋涡状或束本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备口蹄疫种毒的方法，其特征在于，包括：以BHK21贴壁细胞的扁瓶细胞或细胞工厂作为宿主，接入口蹄疫病毒及病毒培养液后进行培养，待细胞病变后收获贴壁种毒，而后将所述贴壁种毒接种于悬浮细胞中培养并获得悬浮种毒；其中，所述病毒培养液中含有HEPES和碳酸氢钠，pH值为7.70～7.85。2.根据权利要求1所述的制备口蹄疫种毒的方法，其特征在于，所述病毒培养液按体积百分比计含有如下组分：1
‑
1.5％的1mol/LHEPES溶液、1.5
‑
2.2％的7.50％碳酸氢钠溶液、余量为0.5％乳依液。3.根据权利要求1或2所述的制备口蹄疫种毒的方法，其特征在于，在接入口蹄疫病毒及病毒培养液时，先用病毒培养液对BHK21贴壁细胞进行涮洗，再按MOI为1:1～1:10进行接种。4.根据权利要求1所述的制备口蹄疫种毒的方法，其特征在于，待达到80～85％的病变比例后收获贴壁种毒。5.根据权利要求1所述的制备口蹄疫种毒的方法，其特征在于，所述方法还包括：将收获得到的贴壁种毒与灭菌的冷冻保护剂混合，而后对混合液进行检验冷冻；所述冷冻保护剂包括甘油和卵白蛋白液，所述冷冻保护剂与所述贴壁种毒的体积比为0.8：1.2～1.5，所述卵白蛋白液占所述混合液总体积的0.8～1.2％。6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡斌，张林冲，郭建军，刘艳霞，赵丽霞，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：