BCLX基因反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了BCLX基因反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用。所述反义寡核苷酸(SSOs)包含如下序列：5

【技术实现步骤摘要】
BCLX基因反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种用于脑胶质瘤放射治疗增敏的剪接调控反义寡核苷酸，具体涉及调控BCLX基因选择性剪接的反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用。

技术介绍

[0002]胶质母细胞瘤(GBM)是起源于中枢神经系统的最常见和最致命的实体肿瘤之一，中位生存期不到12个月，占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80.8％，其发病率排在颅内肿瘤的第一位。GBM具有非常高的侵袭性，且由于其较强的抗药性和辐射耐受，导致预后较差，患者在接受治疗后会很快复发，目前的治疗方法只能起到缓和作用。
[0003]放射治疗(放疗)是指通过致电离辐射射线的促电子电离作用使生物体产生直接和间接的DNA损伤，最终引起肿瘤靶区细胞死亡。目前，放射治疗已经是去除术后残留GBM肿瘤组织的主要辅助治疗，并被用作标准治疗方法。然而，尽管许多GBM患者能够响应最初的放射治疗，但残留的辐射耐受细胞往往会不可避免的导致肿瘤复发，且研究发现辐射后仍然存活的细胞获得了更强的侵袭能力。然而，通过增加辐射剂量来改善病人预后的手段会导致健康脑组织细胞由于暴露在极限耐受剂量而受到损伤。因此，寻找GBM放射治疗过程中产生的潜在放射耐药机制并进行药物抑制有望为安全有效地促进GBM的放疗敏感性提供途径。如何提高放射治疗疗效已成为放疗领域的一大热点话题，药物增敏已有多年的历史，但其疗效和稳定性方面一直不是很理想，因此，迫切需要新的策略来提高放疗的治疗效果。
[0004]近年来，基于BCLX基因选择性剪接调控药物的研究进展为我们这项专利技术的提出提供了契机。BCLX基因的新生转录本能通过选择性剪接产生两种功能相互拮抗的异构体：促凋亡亚型Bcl
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xS和抑凋亡亚型Bcl
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xL。促凋亡Bcl
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xS和抗凋亡Bcl
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xL亚型的比例在调节细胞生存和死亡的切换中起着重要作用，其剪接事件也是最早发现的癌细胞响应凋亡的致癌剪接。
[0005]Splice
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switching oligonucleotides(SSO)，又称剪接转换寡核苷酸，通常为15
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30个核苷酸，是一种合成、经过修饰、发挥空间位阻效应的反义寡核苷酸，广泛用于调控前体mRNA的可变剪接模式。它能够靶新生转录本，从而影响剪接体和关键剪接因子的可及性，但不会导致转录本的降解。天然寡核苷酸具有易降解、亲和力低、脱靶效应高等缺点。对SSOs的磷酸骨架或核糖环进行的各种化学修饰显著提高了其稳定性和亲和力，同时降低细胞毒性和免疫原性。第三代反义寡核苷酸PMOs是一种中性带电核酸，其中呋喃糖环被吗啉环取代。目前，PMOs修饰的SSOs药物Eteplirsen和Golodirsen已被FDA批准分别用于临床治疗杜氏肌萎缩症和脊髓性肌萎缩症。PMO通常需要共价结合细胞穿透肽才能实现体内递送。Gene Tools公司合成了能够实现体内递送的Vivo
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Morpholinos(vMO)，vMO由MO寡核苷酸共轭连接递送基团组成，该递送基团由八胍基树突状分子组成，提高了其稳定性，能够高效的进行细胞及动物体内的药物递送。
tissues.BioTechniques.2008Dec；45(6):616
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26.
[0025][0026]所述反义寡核苷酸基于Vivo
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Morpholinos技术，将Morpholinos与递送基团八胍基树突状分子共轭，通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带SSOs穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。
[0027]所述反义寡核苷酸以及所述载体可被制备成脂质体、纳米材料、微乳液、微球、凝胶或囊泡等剂型，这些剂型的制备方法和所用的辅料均为现有技术。
[0028]本专利技术与现有技术相比具有下列优点：
[0029](1)BCLX剪接转换寡核苷酸协同X射线和/或重离子束，促进肿瘤凋亡相关基因表达，进一步抑制GBM肿瘤细胞的增殖、促进辐照后细胞凋亡增加。
[0030](2)BCLX剪接转换寡核苷酸可直接抑制由于辐射引起的Bcl
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xL上调而导致的辐射耐受事件的发生，同时上调Bcl
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xS亚型的剪接，促进辐照后细胞凋亡。
[0031](3)基于Vivo
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Morpholinos技术，使反义寡核苷酸更加高效，安全的进入细胞和瘤体内发挥作用。
[0032](4)本专利技术所述BCLX剪接转换寡核苷酸联合放疗对人脑胶质瘤细胞诱导凋亡的作用高于单一放疗组，呈现明显放疗增敏协同效应。因此，本专利技术从肿瘤细胞增殖、DNA复制、凋亡、克隆存活等多个层面上提供了BCLX剪接转换寡核苷酸制备放疗增敏试剂的潜在应用价值。
附图说明
[0033]图1为本专利技术vMO直接调节BCLX前体mRNA剪接示意图。
[0034]图2为本专利技术实施例1中vMO进入胶质瘤细胞后进行免疫荧光检测细胞荧光强度图。
[0035]图3为本专利技术实施例1中vMO处理前后胞内Bcl
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xL和Bcl
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xS mRNA比值的表达变化及蛋白水平的表达变化。
[0036]图4为本专利技术实施例1中vMO进入胶质瘤细胞和星形胶质细胞后细胞活力检测图。
[0037]图5为本专利技术实施例1中vMO对3D培养的肿瘤球的细胞毒性。
[0038]图6为本专利技术实施例2中vMO处理后48小时，采用低剂量X射线照射后的24小时，胶质瘤细胞DNA复制情况(EDU嵌入)检测结果图。
[0039]图7为本专利技术实施例3中vMO处理后48小时，采用低剂量X
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射线照射后的24小时，胶质瘤细胞凋亡检测结果图。
[0040]图8为本专利技术实施例4中vMO处理后48小时，采用低剂量X射线照射后的0
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14天，胶质瘤细胞克隆存活分数曲线。
[0041]图9为本专利技术实施例5中vMO处理后48小时，采用低剂量X射线照射后的胶质瘤细胞3D肿瘤球内死细胞染色图。
[0042]图10为本专利技术实施例6中vMO处理后48小时，采用低剂量碳离子束照射后的24小时，胶质瘤细胞凋亡检测结果图。
[0043]图11为本专利技术实施例7中vMO处理后48小时，采用低剂量碳离子束照射后的0
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14天，胶质瘤细胞克隆存活分数曲线。
具体实施方式
[0044]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0045]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.反义寡核苷酸在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用；所述反义寡核苷酸包含如下序列(SEQ ID NO.1)：5
’‑
GCTTGGTTCTTACCCAGCCGCCGTT
‑3’
。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为如下1)
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2)中的任一种：1)抑制Bcl
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xL的剪接，促进Bcl
‑
xS的剪接，显著下调Bcl
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xL/Bcl
‑
xS的比值；2)抑制人脑胶质瘤细胞活力，促进人脑胶质瘤细胞凋亡。3.反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用；所述反义寡核苷酸包含如下序列(SEQ ID NO.1)：5
’‑
GCTTGGTTCTTACCCAGCCGCCGTT
‑3’
。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用中，所述放疗为X射线放疗和/或重离子束放疗。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为反义寡核苷酸在制备具有如下1)
‑
3)中任一项所述功能的药物中的应用：1)人脑胶质瘤的X射线放疗增敏；2)人脑胶质瘤的重离子束放疗增敏；3)阻止X射线和/或重离子束放疗抵抗细胞导致的胶质瘤复发和转移。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：狄翠霞，窦志慧，陈小花，赵大鹏，苏玮，张桃桃，雷惠雯，李强，张红，
申请(专利权)人：中国科学院近代物理研究所，
类型：发明
国别省市：