一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明专利技术还公开了重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法及其在制备抗FHV

【技术实现步骤摘要】
一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法


[0001]本专利技术属于疫苗领域，具体涉及一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，本专利技术还涉及重组融合蛋白纳米颗粒的制备及其在制备抗FHV
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I疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]猫传染性鼻支气管炎的病原体为猫疱疹病毒I型(FHV
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I)，属于疱疹病科甲型疱疹病毒亚科，属于传染性极强的恶性传染病，以上呼吸道感染为主要临床症状，宿主为猫和猫科动物，未接种疫苗的幼猫感染后发病率为100％，成年猫感染后一般不致死，但愈后不良，重症病例可见角膜、鼻甲骨造成永久性损伤。
[0003]目前国内对于该疾病的预防还是依赖于注射美国辉瑞公司生产的“妙三多”宠物疫苗，而国内本土商业化的猫疱疹病毒疫苗目前还是空白，随着国内宠物猫FHV
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1感染病例和分离出感染病毒株多样性的不断增加以及进口“妙三多”疫苗供不应求且不适应本地毒株出现的疫苗保护性下降的问题，着手研制一种可用于预防猫疱疹病毒感染的生物制剂就显得十分重要。
[0004]本专利技术将已经由国内外文献报道的具有病毒中和作用的猫疱疹病毒粒子表面囊膜糖蛋白gD与可以在体内自发组装成60聚体纳米颗粒的Lumazine合酶(Lumazine Synthase，Ls)进行融合表达，制备成多聚体蛋白质纳米颗粒。本专利技术通过真核表达系统表达和纯化出的纳米颗粒具有蛋白表达产量高、生产周期短且操作简单易于放大生产的优点，经验证其蛋白结构折叠正确、具有生物活性，可以为猫疱疹病毒亚单位疫苗的研制提供一种全新且高效的选择方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0006]本专利技术选择具有60个亚基的Ls作为载体，其抗原展示表位丰富，末端靠近对称轴可以稳定三聚体或五聚体抗原的呈递，以确保膜蛋白免疫原的充分暴露。又对病毒gD糖蛋白的氨基酸全长进行了序列分析与抗原性预测，去除了由SignalP 5.0算法预测的Sec/SPI信号肽段，保留了由DNAstar和.SVMTRIP
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B、Karplus&Schulz FIexibility Prediction Results及BepiPred
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2.0数据库对比筛选后的具有B细胞表位与T细胞表位的的膜外糖蛋白肽段，再将其用GS柔性Linker将其与Ls进行连接后进行了融合表达。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种所述重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法，通过分子克隆技术将gD+Ls基因克隆到PfastbacⅠ穿梭载体后利用昆虫
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杆状病毒真核表达系统进行蛋白的表达，具体包括如下步骤：
[0008]S1、设计引物，扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA片段；
[0009]S2、将得到的DNA片段连接到杆状病毒表达载体，构建重组杆粒；
[0010]S3、用重组杆粒转染昆虫细胞，经传代培养，蛋白表达后得到高表达目的蛋白的昆虫细胞；
[0011]S4、琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。
[0012]进一步地，所述引物序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
[0013]所述杆状病毒表达载体为PfastbacI。
[0014]所述昆虫细胞为SF9细胞。
[0015]S3中，将转染后的昆虫细胞传代培养至P4代，用MOI＝10的病毒量感染昆虫细胞96h，得到高表达目的蛋白的昆虫细胞。
[0016]本专利技术利用了昆虫
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杆状病毒真核表达系统来表达重组纳米颗粒，确保了自组装纳米颗粒所展示膜蛋白的正确修饰和自组装纳米颗粒的准确折叠，能够满足体外表达病毒囊膜糖蛋白时所需要的糖基化修饰，可以完整的在体外模拟出蛋白质的正确构象，更好地发挥蛋白质功能，这都是大肠杆菌等其他原核表达系统不能实现的。同时该真核表达系统具有低廉的培养成本、高密度培养方式和全程无血清的培养环境，更利于蛋白质的大量表达和后续的分离纯化。选择的具有Polyhedrin(PH)启动子的杆状病毒表达载体PfastbacI其相较于其他具有P10启动子的杆状病毒表达载体具有更高的蛋白质表达效率，相同时间内蛋白质的表达量更高。选择的SF9昆虫细胞系较其他昆虫细胞系具有转染容易，细胞内蛋白酶含量少，对表达出的蛋白质降解更小的优点。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供所述重组融合蛋白纳米颗粒在制备抗FHV
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I疫苗中的应用。将纯化后的自组装纳米颗粒通过透射电子显微镜拍照，动态光散射仪分析及gD糖蛋白单克隆抗体杂交实验后证实所表达的纳米颗粒具有组装正确，粒径合适，大小分明，具有抗体结合力。另外将其免疫动物验证了免疫原性，可以诱导机体产生中和抗体来中和病毒，并且具有较高的安全性。
[0018]更详尽的技术方案参见具体实施例。
附图说明
[0019]图1：gD+Ls扩增产物的凝胶电泳图。
[0020]图2：gD+Ls
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PfastbacI穿梭质粒的双酶切验证图。
[0021]图3：转染SF9细胞的鉴定(A未转染正常培养的SF9细胞；B重组杆粒转染48h的SF9细胞)。
[0022]图4：gD+Ls蛋白在SF9细胞中的优化表达。
[0023]图5：gD+Ls纳米颗粒纯化产物的SDS
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PAGE鉴定图。
[0024]图6：gD+Ls纳米颗粒纯化产物的WesternBlot鉴定图。
[0025]图7：100KV透射电子显微镜下对gD+Ls纳米颗粒的负染观察图。
[0026]图8：gD+Ls纳米颗粒的粒径统计图。
[0027]图9、图10：gD+Ls纳米颗粒免疫原性的鉴定图。
[0028]图10：免疫小鼠体重的监测。
[0029]图11：iELISA检测0、14、28、42day血清抗体IgG水平。
具体实施方式
[0030]下面通过具体实施例对本专利技术进行下详细说明。
[0031]实施例1猫疱疹病毒表面糖蛋白纳米颗粒的制备
[0032]1.目的基因的克隆
[0033]根据NCBI已公布的FHV
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I基因(NC_013590.2)的gD蛋白基因序列与Ls基因序列(AOO95275.1)设计PCR扩增引物并化学合成。
[0034]gD+Ls
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F:GGATCCATGGTGAGCGCCATCGTG(SEQ ID NO：3)
[0035]gD+Ls
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R:TCACCACCACCACCACTAAAAGCTT(SEQ ID NO：4)
[0036]以含目的基因的质粒(由上海本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.编码权利要求1所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.权利要求1或2所述重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1、设计引物，扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA片段；S2、将得到的DNA片段连接到杆状病毒表达载体，构建重组杆粒；S3、用重组杆粒转染昆虫细胞，经传代培养，蛋白表达后得到高表达目的蛋白的昆虫细胞；S4、琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。4.如权利要求3所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔旻，刘威，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：