一株鼠李糖乳杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株鼠李糖乳杆菌及其应用，属于生物化工技术领域。该鼠李糖乳杆菌的保藏名称为鼠李糖乳杆菌PC30

【技术实现步骤摘要】
(Lactobacillus rhamnosus PC30
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1)，将鼠李糖乳杆菌PC30
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1接种于培养基中，于37℃，150r/min,振荡培养12
‑
18h，获得种子培养液；
[0012]步骤二：将麦冬、半夏、人参、甘草、石膏和淡竹叶切片后，加水煎煮，合并滤液；
[0013]步骤三：将步骤二得到的药渣进行烘干，得到的干药渣加入蒸馏水，进行灭菌后冷却至室温，得到药渣培养液；
[0014]步骤四：将步骤二的种子培养液接种于步骤三的药渣培养液中，于37℃， 150r/min,振荡培养12
‑
18h，离心收集发酵上清，得到复方中药渣发酵液。
[0015]优选的是，所述的步骤一的培养基为MRS液体培养基。
[0016]优选的是，所述的步骤二中中药原料配比为：麦冬30
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50份、半夏15
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25份、人参10
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15份、甘草50
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100份、石膏20
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30份、淡竹叶10
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15份。
[0017]优选的是，所述的步骤二中中药原料配比为：麦冬30份、半夏15份、人参15份、甘草100份、石膏20份、淡竹叶15份。
[0018]优选的是，所述的步骤二中煎煮次数为2次，第一次煎煮时间为1h，第二次煎煮时间为30min，料液比为1:20。
[0019]优选的是，所述的步骤三的烘干温度为室温，晾晒烘干时间为48h。
[0020]优选的是，所述的步骤三中药渣和蒸馏水的料液比为1:10。
[0021]优选的是，所述的步骤三中灭菌温度为121℃，压力为103.4kPa。
[0022]优选的是，所述的步骤四离心收集包括：将药渣发酵液于4℃，8000r/min，离心10min，将离心后所得上清液通过0.45μm滤膜进行真空抽滤，后将滤液于旋转蒸发仪(45℃，75r/min)，旋蒸浓缩至体积比为1:4。
[0023]本专利技术的有益效果
[0024]本专利技术提供一株鼠李糖乳杆菌及其应用，该菌株保藏名称为鼠李糖乳杆菌 PC30
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1(Lactobacillus rhamnosus PC30
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1)，经MRS分离培养基纯化后，得到圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，直径1
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1.5mm，成对或成链排列菌落，革兰氏染色镜检可见分散、成链排列短杆状菌体，16S rDNA序列比对结果显示，该菌与L.rhamnosus序列一致性达99％。
[0025]本专利技术还提供上述鼠李糖乳杆菌在制备复方中药渣发酵液中的应用，本专利技术利用鼠李糖乳杆菌PC30
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1发酵复方中药渣，利用发酵液益生特性提高畜禽的增重效果和抗病力，牛津杯实验结果显示，本专利技术的中药渣浓缩发酵上清液对大肠杆菌ATCC25922株抑菌圈直径约为13
‑
14mm，具有一定抑菌效果，该复方中药渣发酵液能减少或一定程度替代常规抗菌药物的使用，降低药物残留，降低抗菌药物选择压力，抑制或减缓临床致病菌耐药性产生。
附图说明
[0026]图1为牛津杯法测试复方中药发酵液对大肠杆菌标准株ATCC25922抑菌活性照片；
[0027]图2为灌服实施例2的制备药渣发酵液的试验鸡的早重曲线图；
[0028]图3为灌服实施例2的制备药渣发酵液的试验鸡的晚重曲线图
[0029]图4为灌服实施例2的制备药渣发酵液的试验鸡的周增重柱状图；
[0030]图5为血清IL
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6含量的细胞因子柱状图；
[0031]图6为血清IL
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8含量的细胞因子柱状图；
[0032]图7为血清IL
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10含量的细胞因子柱状图；
[0033]图8为血清IFN
‑
γ含量的细胞因子柱状图。
具体实施方式
[0034]实施例1鼠李糖乳杆菌PC30
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1的分离鉴定
[0035](1)分离纯化
[0036]将购置的市售泡菜置于无菌超净工作台中，使用生理盐水将样品10倍梯度稀释，取100μL适宜梯度的稀释液均匀涂布在含有2％碳酸钙的MRS培养基上，将涂布好的培养基置于厌氧罐中，37℃培养48h。挑取有明显溶钙环的不同形态菌落接种在相应的液体培养基中增菌培养24h后，再次划线接种在MRS 固体培养基上，经分离纯化3次后，挑取单个菌落，进行革兰氏染色。将革兰氏染色为阳性的菌落进行增菌培养，在MRS液体培养基(含20％甘油)中
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80℃保存。所有菌株在使用前需经过3次传代培养。经MRS分离培养基纯化后，得到圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，直径1
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1.5mm，成对或成链排列菌落，革兰氏染色镜检可见分散、成链排列短杆状菌体。
[0037](2)16S rDNA测序鉴定
[0038]将纯化后的菌株，挑取单个菌落至5mL液体培养基中增菌培养过夜，使用生工生物工程(上海)股份有限公司细菌DNA基因组抽提试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。
[0039]以上述基因组DNA为模板，由生工生物公司合成细菌16S rDNA通用引物 (正向序列：27F：5
’‑
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
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，反向序列：1492R：5
’ꢀ‑
TACGGYTACCTTG TTACGACTT
‑3’
)对分离菌株16S rDNA特异性片段进行 PCR扩增，50μLPCR反应体系如表1
‑
2所示。PCR扩增程序设置如下，预变性：94℃、5min；变性：94℃、30s；退火：55℃、30s；延伸：72℃、90 s；30个循环；末端延伸：72℃、10min。
[0040]表1 PCR反应体系
[0041]Tab.1 Reaction system of PCR
[0042][0043][0044]取5μL PCR扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1600bp处有清晰条带的样品进行切胶回收，将胶回收产物连接pMD18
‑
T克隆载体，转化至DH5α感受态细胞，将阳性克隆质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。将得到的测序结果采用BLAST与NCBI中的数据进行比对确定其种属。 16S rDNA序列比对结果显示，该菌与L.rhamnosus序列一致性达99％。
[0045]实施例2复方中药发酵液的制备
[0046]步骤一：将实验室保存的鼠李糖乳杆菌PC30
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1按1％接菌量接种于5mL 灭菌MRS液体培养基，于37℃，150r/min,振荡培养12h，获得种子培养液；
[0047]步骤二：称取麦冬30g、半夏15g、人参15g、甘草100g、石膏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株鼠李糖乳杆菌，其特征在于，保藏名称为鼠李糖乳杆菌PC30
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1(Lactobacillus rhamnosus PC30
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1)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉大学，保藏日期为：2022年1月17日，保藏中心编号为：CCTCC NO:M 2022083。2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备复方中药渣发酵液中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的复方中药渣发酵液的制备方法，包括：步骤一：从市售泡菜中分离获得鼠李糖乳杆菌PC30
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1，通过16S rDNA进行菌种鉴定，获得采用保藏号为CCTCC NO:M 2022083的鼠李糖乳杆菌PC30
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1(Lactobacillus rhamnosus PC30
‑2‑
1)，将鼠李糖乳杆菌PC30
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1接种于培养基中，于37℃，150r/min,振荡培养12
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18h，获得种子培养液；步骤二：将麦冬、半夏、人参、甘草、石膏和淡竹叶切片后，加水煎煮，合并滤液；步骤三：将步骤二得到的药渣进行烘干，得到的干药渣加入蒸馏水，进行灭菌后冷却至室温，得到药渣培养液；步骤四：将步骤二的种子培养液接种于步骤三的药渣培养液中，于37℃，150r/min,振荡培养12
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【专利技术属性】
技术研发人员：马红霞，党乔，孔令聪，王一鸣，姜秀云，高云航，贺承光，陈淋淋，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：