靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用。靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，选自ALKBH3sgRNA 102A或ALKBH3sgRNA 102B中的任意一种，所述的ALKBH3sgRNA 102A102A的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的ALKBH3sgRNA 102B的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术提供针对不同ALKBH3外显子的sgRNA能有效靶向ALKBH3基因，将其构建进入CRISPR/Cas9系统，该系统能敲除ALKBH3基因，得到敲除ALKBH3基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中ALKBH3基因的作用机制。细胞株中ALKBH3基因的作用机制。细胞株中ALKBH3基因的作用机制。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学与基因工程领域，涉及靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用。

技术介绍

[0002]AlkB同系物3(AlkB Homolog 3,ALKBH3)属于AlkB家族，是一种依赖于Fe
2+
和α
‑
酮戊二酸(α
‑
KG)的去甲基化酶，可以去除单链DNA或RNA上的m1A(N6
‑
甲基腺嘌呤)，m3C(3
‑
甲基胞嘧啶)修饰。ALKBH3最早被称为PCA
‑
1，因为其在前列腺癌中高度表达，是前列腺癌的诊断标志之一。此外ALKBH3还在胰腺癌，非小细胞肺癌中高表达，促进胰腺癌和非小细胞肺癌等癌细胞的增殖、侵袭和迁移。ALKBH3在细胞核与细胞基质中均有分布，不同亚细胞定位的ALKBH3功能存在差异。作为核酸损伤修复酶定位于细胞核的ALKBH3可与激活信号协整复合体(ASCCs)协同，富集在转录相关位点，修复高表达基因的转录相关DNA烷基化损伤，保持DNA稳定性，维持基因组的完整性，保证细胞正常生命活动。定位于细胞质的ALKBH3以tRNA为底物，发挥其去甲基化酶的活性，去除tRNA上的m6A修饰以促进癌细胞的蛋白质翻译。ALKBH3还可以通过去除tRNA上的m1A修饰从而降低tRNA的稳定性来增加tDRs(tRNA
‑
derived small RNAs)的产生，以抵抗细胞凋亡最终促进癌症的进程。所以进一步揭示ALKBH3的分子调控机制对了解细胞DNA损伤修复和癌细胞发生发展具有重要意义。
[0003]CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是存在于众多细菌和许多古菌基因组中的串联重复序列,是细菌和古菌长期进化而来的阻止外来病毒的入侵的适应性免疫系统的组成部分。II型的CRISPR/Cas9系统是应用最广泛的一种，其作为一种高效、精确、强大的基因编辑工具使基础科学研究发生了革命性变化。
[0004]现在针对ALKBH3的研究大部分都只是利用RNA干扰的手段，从mRNA层面阻断ALKBH3的表达，无法改变ALKBH3的基因型，敲除效率较低，不适用于长期研究。在针对ALKBH3分子机制的研究中存在缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用。
[0007]本专利技术的再一目的在于提供靶向敲除ALKBH3基因的人肾上皮HEK 293细胞的应用。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，选自DNA序列如下的ALKBH3 sgRNA 102A或ALKBH3 sgRNA 102B：
[0010]ALKBH3 sgRNA 102A102 A的序列如下：
[0011]ALKBH3 sgRNA 102A oligo1：5
’‑
caccg CTGCTAAGAGCCATCTCCAC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0012]ALKBH3 sgRNA 102A oligo2：5
’‑
aaac GTGGAGATGGCTCTTAGCAGc
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0013]ALKBH3 sgRNA 102B的序列如下：
[0014]ALKBH3 sgRNA 102B oligo1：5
’‑
caccg AACCGCATTGAAGAGAACAC
‑3’
(SEQ ID NO.3)；
[0015]ALKBH3 sgRNA 102B oligo2：5
’‑
aaac GTGTTCTCTTCAATGCGGTTc
‑3’
(SEQ ID NO.4)。
[0016]一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列。
[0017]所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：
[0018](1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；
[0019](2)将上述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统。
[0020]步骤(2)中所述靶向敲除ALKBH3基因外显子3的sgRNA的DNA序列命名为LentiCRISPR
‑
ALKBH3
‑
102 A。靶向敲除ALKBH3基因外显子8的sgRNA的DNA序列优选为LentiCRISPR
‑
ALKBH3
‑
102 B。
[0021]步骤(2)中所述的DNA序列是将寡核苷酸链1(oligo1)和寡核苷酸链2(oligo2)退火得到双链序列。
[0022]所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统在制备敲除ALKBH3基因的细胞株中的应用。
[0023]一种敲除ALKBH3基因的细胞株，是将所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。
[0024]所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，具体是通过如下步骤构建得到：
[0025]1)将所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；
[0026]2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，筛选得到敲除ALKBH3基因的细胞株。
[0027]所述的目的细胞株优选为人肾上皮细胞系。
[0028]所述的人肾上皮细胞系优选为HEK 293细胞株。
[0029]所述的敲除ALKBH3基因的细胞株，是HEK 293细胞中的ALKBH3基因缺失核苷酸得到的细胞株，为如下的细胞株1、2中的任一株：
[0030]细胞株1是在野生型ALKBH3基因的靶向敲除位点上缺失4个碱基；细胞株2是在野生型ALKBH3基因的靶向敲除位点上有13个碱基缺失；ALKBH3基因的具体靶向敲除位点如图4所示。
[0031]本专利技术对于现有技术具有如下优点及效果：
[0032]本专利技术提供针对不同ALKBH3外显子的sgRNA能有效靶向ALKBH3基因，将其构建进入CRISPR/Cas9系统，该系统能敲除ALKBH3基因，得到敲除ALKBH3基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA，其特征在于选自ALKBH3 sgRNA 102A或ALKBH3 sgRNA 102B中的任意一种，所述的ALKBH3 sgRNA 102A102 A的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的ALKBH3 sgRNA 102B的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。2.一种靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统，其特征在于含有权利要求1所述的靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列。3.权利要求2所述的所述的靶向敲除ALKBH3基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体；(2)将所述靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的CRISPR/Cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除ALKBH3基因的CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：周君，周建衡，高静，周琦，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：