一种改造的重组凝血因子VIII及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，更具体地，涉及一种改造的重组凝血因子VIII及其应用。所述重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中插入有一个或多个特定的vWF结合位点序列。该改造策略显著提高了FVIII蛋白在细胞和体内的分泌后水平及凝血活性，并且改造后的重组凝血因子VIII在大小上仍能够被rAAV载体包装。相比于原始的FVIII

【技术实现步骤摘要】
一种改造的重组凝血因子VIII及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种改造的重组凝血因子VIII及其应用。

技术介绍

[0002]血友病A(Hemophilia A,HA)，又称凝血八因子(FVIII)缺乏症，是一种伴X染色体隐性遗传出血性疾病；患者由于FVIII编码基因突变或缺失，导致功能性FVIII蛋白缺失，进而凝血功能异常。血友病A的发病率没有地区和种族差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，约占血友病患者的80％～85％，其中2/3为重度；女性血友病患者则较为罕见。据2018年统计数据，全球血友病A患者人数为65.8万，中国为11.9万。患者出生即可发病，伴随终生；症状上常见为受伤后持续缓慢出血，无明显诱因的关节和肌肉出血。如果血友病A患者得不到标准规范的治疗，将有很高的致残和致死率。
[0003]现在用于血友病A治疗的药物主要有三类：外源性FVIII蛋白注射液、艾美赛珠单抗(Emicizumab)和rAAV基因药物。外源性FVIII蛋白注射液，需要每周注射2
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3次，且仅能维持重度血友病A患者(体内FVIII活性小于1％)体内FVIII活性大于1％；艾美赛珠单抗也需要每周注射一次，其仅能维持重度血友病A患者体内FVIII活性为5
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10％。两者频繁的日常注射给患者带来的很大的不便和副作用，且维持的FVIII活性水平不高。当体内FVIII活性在1％
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5％时，患者仍有自发性组织出血的风险；而体内FVIII活性在5％
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25％时，创伤和术后会明显出血。患者仍受疾病所带来的困扰。相比于前两种药物，2022年8月份上市的rAAV药物Roctavian(valoctocogene roxaparvovec)只需一次注射，就能在1年内维持患者体内平均41.9％的FVIII活性，在5年内仍能维持体内超过5％的FVIII活性(参见M.C Ozelo et al,Valoctocogene Roxaparvovec Gene Therapy for Hemophilia A,New England Journal of Medicine,2022,386(11),1013
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1025)。这不仅从治疗手段上减轻了患者的痛苦，在效果上也明显优于其他药物。
[0004]腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组型AAV(recombinant AAV，rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点。近年来，用rAAV作基因治疗载体递送治疗性核酸，已成为基因治疗研究的热点。自2012年第一款AAV药物(Glybera)上市以来，截至2022年11月，已有6款AAV基因治疗药物被批准上市，发展迅猛。但是rAAV作为基因治疗载体也存在明显缺点：其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如天然的FVIII基因，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FVIII前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。
[0005]FVIII前体蛋白是由A1
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a1
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A2
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a2
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B
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a3
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A3
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C1
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C2九个结构域组成，剪切后构成功能性FVIII蛋白的重链(A1
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a1
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A2
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a2
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B)和轻链(A3
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C1
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C2)(图1)。其中B结构域(741
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1648aa)对于FVIII的活性没有直接贡献，却占据FVIII前体蛋白38％的长度。为了满足rAAV药物的容量需求，Lind等人通过用14个氨基酸衔接肽(SQ序列)替换FVIII前体蛋白的B结构域，得到改造后的FVIII
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SQ蛋白(图2)，将需要用载体递送的基因大小降至4.4kb。目前BioMarin公司新上市血友病A药物Roctavian(授权专利：CN105636981B)及Spark公司在临床实验阶段的药物SPK
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8011(专利申请公布号：CN113226352A)均是使用rAAV载体表达FVIII
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SQ蛋白。
[0006]虽然Roctavian作为药物有着不错的效果，但是目前利用FVIII
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SQ进行基因治疗时，仍存在蛋白分泌和功能较低的情况。这不仅影响了rAAV药物治疗的效果，还要求较高的给药剂量，比如Roctavian需要6E+13vg/kg的注射剂量，才能使重度血友病A患者达到体内平均49.1％的FVIII凝血活性，且随着时间推移患者体内的FVIII表达的量以及FVIII活性会逐步降低。高剂量的rAAV药物不但增加了个人和社会的经济负担，还会引起一系列不良反应，比如，转氨酶升高、肝细胞凋亡、炎症反应等(参见Radoslaw Kaczmarek,Gene therapy
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are we ready now？,Haemophilia,2022,28,35
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43)。因此，如何提高rAAV药物的药效，降低给药剂量，是rAAV药物重点的研究领域之一。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种重组凝血因子VIII及其应用，所述重组凝血因子VIII的B结构域被替换为含有一个或多个vWF结合位点的SQ序列。该改造策略显著提高了FVIII蛋白在细胞和体内的分泌后水平及凝血活性，并且改造后的重组凝血因子VIII在大小上仍能够被rAAV载体包装。相比于原始的FVIII
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SQ蛋白，改造的重组凝血因子VIII在被rAAV载体递送后，动物体内的FVIII浓度有着显著的提高。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种重组凝血因子VIII，所述重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中含有一个或多个vWF结合位点；所述vWF结合位点具有：
[0009](1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或
[0010](2)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；或
[0011](3)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
[0012]优选地，所述SQ序列包括前端SQ
a
部分和后端本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组凝血因子VIII，其特征在于，所述重组凝血因子VIII的B结构域包括SQ序列，且所述SQ序列中含有一个或多个vWF结合位点；所述vWF结合位点具有(1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或(2)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；或(3)与SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的重组凝血因子VIII，其特征在于，所述SQ序列包括前端SQ
a
部分和后端SQ
b
部分，所述前端SQ
a
部分的序列为SFS，所述后端SQ
b
部分的序列为QNPPVLKRHQR；所述一个或多个vWF结合位点被插入至所述SQ序列的前端SQ
a
部分和后端SQ
b
部分之间。3.如权利要求1所述的重组凝血因子VIII，其特征在于，其编码基因中包括：(1)由SEQ ID NO：3所示的核酸序列；或(2)与序列SEQ ID NO：3限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或(3)SEQ ID NO：3所示的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：福因医药科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：