因子VIII构建体制造技术

本发明专利技术涉及因子VIII(FVIII)多肽、包含因子VIII核苷酸序列的多核苷酸和重组AAV构建体。本发明专利技术进一步涉及包含本发明专利技术的重组AAV构建体的AAV病毒颗粒，以及包含本发明专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体或AAV病毒颗粒的组合物。本发明专利技术还涉及使用本发明专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体、AAV病毒颗粒和/或组合物的方法和用途。本发明专利技术还涉及本发明专利技术的重组AAV构建体用于产生AAV病毒颗粒的用途，以及使用本发明专利技术的重组AAV构建体产生AAV病毒颗粒的方法。病毒颗粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】因子VIII构建体
专利

[0001]本专利技术涉及因子VIII(FVIII)多肽、包含因子VIII核苷酸序列的多核苷酸和重组AAV构建体。本专利技术进一步涉及包含本专利技术的重组AAV构建体的AAV病毒颗粒，以及包含本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体或AAV病毒颗粒的组合物。本专利技术还涉及使用本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体、AAV病毒颗粒和/或组合物的方法和用途。
[0002]专利技术背景
[0003]A型血友病是由凝血因子VIII缺乏引起的出血性疾病。它影响全世界1:4,000到1:5,000的活产男性。大多数病例是作为X连锁隐性性状遗传的。目前的治疗包括频繁静脉注射(每周2
‑
3次)因子VIII蛋白。这种治疗在止血方面非常有效，但其不是治愈性的，并且非常昂贵(150,000英镑/患者/年)，因此使得世界上大多数A型血友病患者都负担不起。A型血友病的基因治疗提供了通过在将因子VIII基因的功能拷贝转移到受影响的患者后持续、内源性产生因子VIII来治愈的可能性。
[0004]因子VIII由六个结构域组成，即A1
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A2
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B
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A3
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C1
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C2。VIII因子以非活性形式在血液中循环，同时与血管性血友病因子结合。作为对损伤的反应，因子VIII被活化(通常称为因子VIIIa)并与血管性血友病因子分离。因子VIIIa在凝血级联中与因子IXa相互作用。特别地，因子FVIIIa是因子IXa在因子X活化中的辅因子。
[0005]专利技术概述
[0006]本专利技术涉及有利地短的因子VIII多肽和有利地短的可表达因子VIII多肽的重组AAV构建体。可以表达因子VIII多肽的重组AAV构建体是已知的并且通常具有超过5000个核苷酸的大小。因此，它们明显大于长度约为4700个核苷酸的典型野生型AAV基因组大小。本专利技术人成功地缩短了因子VIII多肽的长度和因子VIII核苷酸序列的长度。本专利技术人还设法成功地缩短了重组AAV构建体的其他组分的长度。通过缩短因子VIII核苷酸序列和/或重组AAV构建体的一种或多种其他组分的长度，重组AAV构建体的大小可以小于4900个核苷酸，优选小于4800个核苷酸，因此有利地接近野生型AAV基因组的长度。缩短因子VIII多肽的长度还具有进一步的优势，例如减少与制造相关的负担，例如时间和成本。
[0007]本专利技术人还发现本专利技术的一些内部截短的因子VIII多肽具有保持或增加因子VIII多肽活性的进一步优点。缺乏对应于SEQ ID NO：1的位置1645至1648的PACE/弗林蛋白酶切割位点的内部截短的因子VIII多肽可以表达为单链多肽，并且相对于保留PACE/弗林蛋白酶切割位点的因子VIII多肽可以具有增加的稳定性和/或比活性。已发现缺乏对应于B结构域N端的SEQ ID NO：1的位置724
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740的残基的内部截短的因子VIII多肽保留了因子VIII活性并且可以以更高水平表达。对应于SEQ ID NO：1的位置714
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723的残基可以促进凝血酶结合并且可以任选地保留在本专利技术的内部截短的因子VIII多肽中。还发现缺乏对应于B结构域C端的SEQ ID NO：1的位置1649
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1669的残基的内部截短的因子VIII多肽保留FVIII活性并且可以以更高的水平表达。对应于SEQ ID NO：1的位置1670
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1689的残基(任选对应于SEQ ID NO：1的位置1670
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1678的残基)可能是血管性血友病因子结合所必需的，并且可
以任选地保留在本专利技术的因子VIII多肽中。因此，本专利技术人已经鉴定了许多内部截短的因子VIII多肽，其保留了因子VIII活性并且在体内和在AAV介导的基因治疗中良好表达，并且比本领域的因子VIII多肽小。
[0008]本专利技术人发现，本文所述的因子VIII核苷酸序列的密码子优化也导致因子VIII多肽的增加的表达的优势。因此，本专利技术还涉及编码因子VIII多肽的多核苷酸序列。
[0009]在第一方面，本专利技术提供了包含因子VIII氨基酸序列的因子VIII多肽，其中因子VIII氨基酸序列包含相对于野生型BDR区被修饰的修饰的β结构域相关(BDR)区，其野生型BDR区对应于SEQ ID NO：1的位置713和1697之间的区域，其中：
[0010](i)修饰的BDR区包含最多88个氨基酸，并且因子VIII多肽的比活性高于SEQ ID NO：7的多肽的比活性；和/或
[0011](ii)修饰的BDR区包含最多74个氨基酸。
[0012]在第二方面，提供了包含因子VIII核苷酸序列的多核苷酸，其中所述因子VIII核苷酸序列编码因子VIII多肽并且其中所述因子VIII核苷酸序列的至少一部分不是野生型的。
[0013]在第三方面，提供了包含含有因子VIII核苷酸序列的多核苷酸的重组AAV构建体，其中因子VIII核苷酸序列编码包含因子VIII氨基酸序列的因子VIII多肽。
[0014]在第四方面，提供了包含本专利技术的重组AAV的AAV病毒颗粒。
[0015]在第五方面，提供了由本专利技术的多核苷酸或重组AAV构建体编码的因子FVIII多肽。
[0016]在第六方面，提供了包含本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体或AAV病毒颗粒的组合物。
[0017]在第七方面，提供了用于治疗方法的本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体、AAV病毒颗粒或组合物。
[0018]在第八方面，提供了一种治疗方法，包括向患者施用有效量的本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体或AAV病毒颗粒。
[0019]在第九方面，提供了本专利技术的因子VIII多肽、多核苷酸、重组AAV构建体、AAV病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物中的用途。
[0020]在第十方面，提供了本专利技术的重组AAV构建体用于产生AAV病毒颗粒群的用途。
[0021]在第十一方面，提供了长度小于4900个核苷酸的本专利技术的重组AAV构建体的用途，其用于：
[0022]a)与当使用比较重组AAV构建体时获得的载体基因组产率相比，在AAV病毒颗粒产生过程中增加载体基因组产率；
[0023]b)与当使用比较重组AAV构建体时获得的载体基因组与总颗粒的比率相比，在AAV病毒颗粒产生过程中增加载体基因组与总颗粒的比率；和/或
[0024]c)与当使用比较重组AAV构建体时获得的核酸杂质水平相比，降低AAV病毒颗粒产生过程中的核酸杂质水平；
[0025]其中比较重组AAV构建体的长度超过4900个核苷酸。
[0026]在第十二方面，提供了产生AAV病毒颗粒群的方法，包括：
[0027]a)获得本专利技术的重组AAV构建体；
[0028]b)用所述重组AAV构建体转染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组AAV构建体，其长度小于4900个核苷酸并且包含含有因子VIII核苷酸序列的多核苷酸，其中因子VIII核苷酸序列编码包含因子VIII氨基酸序列的因子VIII多肽。2.根据权利要求1所述的重组AAV构建体，其为：(i)4700至4900，4850至4900，或约4713个核苷酸的长度；和/或(ii)少于4850、少于4800或少于4750个核苷酸的长度；和/或(iii)4700至4900、4700至4850、4700至4800、4700至4750或约4713个核苷酸的长度。3.根据权利要求1或2所述的重组AAV构建体，其中所述因子VIII氨基酸序列：(i)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置746至1639的氨基酸；和/或(ii)是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组AAV构建体，进一步包含转录调节元件，任选地其中所述转录调节元件：(i)包含肝特异性启动子；和/或(ii)长度少于270个核苷酸；和/或(iii)包含核心核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO：43具有至少95％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：43有单个核苷酸不同的序列或由其组成，并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；任选地，其中转录调节元件的长度为80至225个核苷酸；和/或(iv)包含核心核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO：43具有至少95％同一性的序列或与SEQ ID NO：43有单个核苷酸不同的序列或由其组成，其中转录调节元件：(a)不包含SEQ ID NO：48的至少20、至少30或至少40个连续核苷酸和/或(b)不包含SEQ ID NO：49的至少20、至少30或至少40个连续核苷酸；并且其中转录调节元件的长度为80至280个核苷酸；和/或(v)包含与SEQ ID NO：51具有至少90％同一性、任选地至少95％同一性或任选地至少98％同一性的序列或由其组成；和/或(vi)包含SEQ ID NO：51的序列或由其组成；和/或(vii)与因子VIII核苷酸序列可操作地连接；和/或(viii)与因子VIII核苷酸序列可操作地连接，并且其中与由SEQ ID NO：52定义的转录调节元件相比，转录调节元件50％或更好、80％或更好或100％或更好地表达因子VIII核苷酸序列，任选地其中因子VIII核苷酸序列的表达是在体外在Huh7细胞中测定的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组AAV构建体，进一步包含编码信号肽的核苷酸序列，任选地其中：(I)(i)信号肽是野生型因子VIII信号肽；和/或(ii)信号肽包含SEQ ID NO：53或其中编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：54或55；或者(II)(i)信号肽不是野生型因子VIII信号肽；和/或(ii)与施用等量剂量的包含野生型因子VIII信号肽的重组AAV构建体相比，施用重组AAV构建体后，由因子VIII核苷酸序列编码的因子VIII多肽或其片段在血浆中以更高的水平表达；和/或(iii)与包含野生型因子VIII信号肽的等同重组AAV构建体相比，由因子VIII核苷酸序列编码的因子VIII多肽或其片段在血浆中以至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.8
倍、至少2倍、至少5倍的水平表达；和/或(iv)信号肽包含与SEQ ID NO：56、58或60中任一个的序列至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。6.根据权利要求5所述的重组AAV构建体，其中：(a)信号肽包含SEQ ID NO：56或其中编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：57；或者(b)信号肽包含SEQ ID NO：60或其中编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：61；或者(c)信号肽包含SEQ ID NO：58或其中编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：59。7.根据权利要求5或6所述的重组AAV构建体，其中编码信号肽的核苷酸序列的长度小于57个核苷酸或长度为约54个核苷酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，进一步包含多聚A核苷酸序列，任选地其中所述多聚A核苷酸序列：(i)包含SEQ ID NO：63至66中任一个的核苷酸序列；和/或(ii)长度少于50个或为约49个核苷酸；和/或(iii)包含SEQ ID NO：65的核苷酸序列。9.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，进一步包含一个或两个ITR，任选地其中：(i)该或每个ITR的核苷酸序列的长度少于157、少于154或为约145个核苷酸；和/或(ii)该或每个ITR是野生型ITR；和/或(iii)该或每个ITR是AAV2 ITR；和/或(iv)该或每个ITR的核苷酸序列包含SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：70的核苷酸序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，其中：(i)编码因子VIII氨基酸序列的因子VIII核苷酸序列包含SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：75的序列，并且编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：57的核苷酸序列；和(ii)重组AAV构建体包含转录调节元件，其为肝特异性启动子，并且肝特异性启动子包含SEQ ID NO：51的核苷酸序列；和(iii)重组AAV构建体包含两个ITR和一个多聚A核苷酸序列，其中每个ITR的核苷酸序列是SEQ ID NO：67和/或SEQ ID NO：70，并且多聚A核苷酸序列包含SEQ ID NO:65的核苷酸序列。11.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，其中所述重组AAV构建体包含SEQ ID NO：71或由其组成。12.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，其中：(i)与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的载体基因组产率相比，当使用所述重组AAV构建体产生AAV病毒颗粒时，载体基因组产率增加；和/或(ii)与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的载体基因组产率相比，当使用所述重组AAV构建体产生AAV病毒颗粒时，载体基因组产率增加，并且载体基因组产率是当使用比较重组AAV构建体时获得的载体基因组产率的至少1.5、至少2、至少2.25、至少2.5、至少2.75、至少3、至少4或至少5倍，任选地，其中载体基因组产率是当使用
比较重组AAV构建体时获得的载体基因组产率的1.25至3倍、1.5至3倍或2至3倍。13.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，其中：(i)与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的载体基因组与总颗粒的比率相比，当使用所述重组AAV构建体产生AAV病毒颗粒时，载体基因组与总颗粒的比率增加；和/或(ii)与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的载体基因组与总颗粒的比率相比，当使用所述重组AAV构建体产生AAV病毒颗粒时，载体基因组与总颗粒的比率增加，并且载体基因组与总颗粒的比率是当使用比较重组AAV构建体时获得的载体基因组与总颗粒的比率的至少1.25、至少1.5、至少1.75、至少2、至少2.25、至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5、至少4或至少5倍，任选地其中载体基因组与总颗粒的比率是当使用比较重组AAV构建体时获得的载体基因组与总颗粒的比率的1.25至4倍或1.5至3.5倍。14.根据前述权利要求中任一项所述的重组AAV构建体，其中：(i)当所述重组AAV构建体用于产生AAV病毒颗粒时，与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的杂质水平相比，核酸杂质水平、任选地质粒衍生的杂质水平降低；和/或(ii)当所述重组AAV构建体用于产生AAV病毒颗粒时，与当使用长度超过4900个核苷酸的比较重组AAV构建体时获得的杂质水平相比，核酸杂质水平、任选地质粒衍生的杂质水平降低，并且核酸杂质水平与当使用比较重组AAV构建体时获得的核酸杂质水平相比为85％或更低、75％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低或20％或更低，任选地其中核酸杂质水平是当使用比较重组AAV构建体时获得的核酸杂质水平的40％至80％，或50％至70％，或15％至55％。15.根据权利要求12至14中任一项所述的重组AAV构建体，其中比较重组AAV构建体的长度大于4910、大于4920、大于4930、大于4940、大于4950、大于4960、大于4970、大于4980、大于4990或大于5000个核苷酸，任选地其中比较重组AAV构建体包含SEQ ID NO：72或由其组成。16.包含因子VIII氨基酸序列的因子VIII多肽，其中因子VIII氨基酸序列包含相对于野生型BDR区被修饰的修饰的β结构域相关(BDR)区，该野生型BDR区对应于SEQ ID NO：1的位置713和1697之间的区域，其中：(iii)修饰的BDR区最多包含88个氨基酸，并且因子VIII多肽的比活性高于SEQ ID NO：7的多肽的比活性；和/或(iv)修饰的BDR区最多包含74个氨基酸。17.根据权利要求16所述的因子VIII多肽，其中：(i)因子VIII多肽的比活性为参考野生型因子VIII多肽，任选SEQ ID NO：1的因子VIII多肽的比活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％；和/或(ii)因子VIII多肽的比活性高于参考野生型因子VIII多肽、任选SEQ ID NO：1的因子VIII多肽的比活性；和/或(iii)因子VIII多肽的比活性为参考野生型因子VIII，任选SEQ ID NO：1的因子VIII多
肽的比活性至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或至少5.5倍；和/或(iv)因子VIII多肽的比活性为SEQ ID NO：7的因子VIII多肽的比活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％；和/或(v)因子VIII多肽的比活性高于SEQ ID NO：7的因子VIII多肽的比活性；和/或(vi)因子VIII多肽的比活性为SEQ ID NO：7的因子VIII多肽的比活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或至少5.5倍；和/或(vii)因子VIII多肽的比活性为SEQ ID NO：8的因子VIII多肽的比活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％；和/或(viii)因子VIII多肽的比活性高于SEQ ID NO：8的因子VIII多肽的比活性；和/或(ix)因子VIII多肽的比活性为SEQ ID NO：8的因子VIII多肽的比活性的至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍或至少5.5倍；和/或(x)因子VIII多肽具有比由SEQ ID NO：37编码的因子VIII多肽的比活性更高的比活性；和/或(xi)因子VIII多肽具有比由SEQ ID NO：38编码的因子VIII多肽的比活性更高的比活性；和/或(xii)使用生色测定法测量比活性；和/或(xiii)使用凝血测定法，任选地使用一步凝血测定法测量比活性；和/或(xiv)修饰的BDR区包含最多87、85、80、75、70、65、60、55、50或45个氨基酸；和/或(xv)修饰的BDR区包含最多74个氨基酸；和/或(xvi)修饰的BDR区包含最多47个氨基酸；和/或(xvii)修饰的BDR区包含最多45个氨基酸；和/或(xviii)修饰的BDR区由28至48个氨基酸组成；和/或(xix)修饰的BDR区由30至48个氨基酸组成；和/或(xx)修饰的BDR区由约45个氨基酸组成。18.根据权利要求16或17所述的因子VIII多肽，其中所述因子VIII氨基酸序列：(i)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸；和/或(ii)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置724至731的氨基酸；和/或(iii)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置1670至1689的氨基酸；和/或(iv)不包含对应于SEQ ID NO：1的732至1669位的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置724至731和1670至1689的氨基酸；和/或(v)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置724至731和1670至1689的氨基酸和对应于SEQ ID NO：1的
位置718、719和723的酪氨酸氨基酸；和/或(vi)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置714至731和1670至1689的氨基酸；和/或(vii)不包含对应于SEQ ID NO：1的位置732至1669的氨基酸，并且因子VIII氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：1的位置1至731和1670至2332的氨基酸；和/或(viii)包含SEQ ID NO：31；和/或(ix)包含SEQ ID NO：9
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36中的任一个。19.根据权利要求16至18中任一项所述的因子VIII多肽，其中所述因子VIII氨基酸序列在结构域间界面处包含一个或多个取代突变，所述结构域间界面选自：d.A1/A3结构域界面；e.A2/A3结构域界面；或者f.A1/C2结构域界面，其中：(iii)一个或多个取代突变包括用更疏水的氨基酸取代氨基酸；或者(iv)一个或多个取代突变包括用半胱氨酸残基取代各自结构域中的一对氨基酸；并且其中(a)因子VIII多肽具有比参考野生型因子VIII多肽更高的比活性；和/或(b)因子VIII多肽具有比参考野生型因子VIII多肽更高的稳定性；和/或(c)因子VIII多肽在宿主细胞中以比参考野生型因子VIII多肽更高的水平表达。20.根据权利要求16至18中任一项所述的因子VIII多肽，其中所述因子VIII氨基酸序列包含一个或多个选自以下的取代突变：c.对应于SEQ ID NO：1的M662或H693的氨基酸的取代；或者d.用半胱氨酸残基取代包含第一氨基酸和第二氨基酸的一对氨基酸，其中：1.第一氨基酸对应于SEQ ID NO：1的M147、S149或S289，第二氨基酸对应于SEQ ID NO：1的E1969、E1970或N1977；2.第一氨基酸对应于SEQ ID NO：1的T667、T669、N684、L687、I689、S695或F697，第二氨基酸对应于SEQ ID NO：1的S1791、G1799、A1800、R1803、E1844、S1949、G1981、V1982或Y1979；或者3.第一氨基酸对应于SEQ ID NO：1的A108、T118或V137，第二氨基酸对应于SEQ ID NO：1的N2172、Q2329或Y2332。21.根据权利要求19或20所述的因子VIII多肽，其中所述因子VIII多肽：...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：自由行疗法有限公司，
类型：发明
国别省市：