一种降解胞内肿瘤增殖蛋白的细菌制造技术

本发明专利技术一种基于细菌载体特异性降解胞内蛋白质治疗肿瘤的药物制备和应用，属于生物医药领域。本发明专利技术利用细菌作为载体，表达能够特异性靶向降解胞内蛋白质的一种融合蛋白，阻断肿瘤细胞增殖的同时能够引起细胞免疫原性死亡，以达到肿瘤治疗的目的。以达到肿瘤治疗的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种降解胞内肿瘤增殖蛋白的细菌
一、

[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种基于细菌载体特异性降解胞内增殖蛋白治疗肿瘤的药物制备和应用。
二、
技术介绍

[0002]癌症仍然是人类难以解决的一种主要疾病。目前越来越多的研究者聚焦于免疫治疗，如PD
‑
1等免疫检查点抑制剂、针对不同靶点的小分子抑制剂、针对肿瘤抗原的肿瘤疫苗等。
[0003]靶向蛋白降解(Targeted Protein Degradation，TPD)为药物的发现提供了前所未有的机会。蛋白降解靶向联合体(proteolysis
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targeting chimeras，PROTAC)利用泛素
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蛋白酶体系统选择性地诱导靶向蛋白降解，是一种新兴的治疗技术，具有调节传统不可用药靶点的潜力。PROTAC其中一端能够靶向目标蛋白并与之结合，另一端能够招募E3泛素连接酶(E3 ligase)，E3 ligase将目标蛋白泛素化，通过泛素
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蛋白酶体途径将目标蛋白降解。该技术已经进入临床试验，改变了小分子药物的前景，但也面临着新的挑战，如难以筛选出高特异性靶向目标蛋白的分子，且E3 ligase可选择的种类较少等。另外，蛋白质分子量较大，向胞内的递送效率低是亟需解决的问题。目前已有研究利用mRNA编码PROTAC融合蛋白后将其直接在胞内表达。然而，mRNA本身在机体内较易被核酶降解，且递送效率较低，因此常用阳离子脂质体作为递送系统，而阳离子脂质体系统给药后富集于肝脏，难以靶向肿瘤精准递送，且阳离子脂质体本身具有毒副作用。
[0004]本研究采用的PROTAC靶点是增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，是细胞增殖过程中DNA复制所需的辅助蛋白，将其降解后，DNA复制无法正常进行，因此细胞周期停滞，肿瘤细胞停止扩增。同时由于PCNA是DNA复制的关键蛋白，PCNA被降解能够导致DNA复制异常，损伤的DNA片段流入细胞质中，激活cGAS
‑
STING信号通路，从而引起细胞免疫原性死亡(immunogenic cell death)，能够在肿瘤内部引起级联反应，促进机体对肿瘤的免疫杀伤。
[0005]本研究采用敲除鞭毛蛋白的减毒沙门氏菌VNP20009作为载体，导入表达靶向PCNA的融合蛋白，利用细菌载体作为PROTAC的递送系统。减毒沙门氏菌由于其厌氧特性，在进入机体后会富集在缺氧的肿瘤微环境中，游离在体内的少部分细菌会被巨噬细胞吞噬清除而不对正常细胞造成影响。减毒沙门氏菌富集在肿瘤内部后，由于其鞭毛蛋白被敲除，无法从胞内逃逸，因此能够定植于细胞质内，不断表达靶向PCNA的融合蛋白，成为一个“蛋白质工厂”，特异性将PCNA蛋白降解。本研究采用的细菌载体递送PROTAC能够特异性靶向肿瘤内PCNA蛋白，将其降解，阻滞肿瘤细胞周期，抑制肿瘤生长，将不可成药靶点成为可能，同时具有较高的安全性。
三、
技术实现思路

[0006]1.专利技术目的
[0007]本专利技术构建一种基于细菌载体特异性降解胞内蛋白质治疗肿瘤的药物，利用减毒沙门氏菌表达一种融合蛋白，一端为招募E3泛素连接酶(E3 ligase)的结构域，另一端为特异性靶向增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合域，中间用连接序列linker连接为融合蛋白。E3 ligase招募结构域能够富集E3泛素连接酶，将PCNA结合域结合的PCNA泛素化，通过泛素
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蛋白酶体途径将其降解。从而使得肿瘤细胞周期停滞，不再增殖，同时由于PCNA是DNA复制的关键蛋白，PCNA被降解能够导致DNA复制异常，损伤的DNA片段流入细胞质中，激活cGAS
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STING信号通路，从而引起细胞免疫原性死亡(immunogenic cell death)，能够在肿瘤内部引起级联反应，促进机体对肿瘤的免疫杀伤。
[0008]2.技术解决方案
[0009]2.1.鞭毛基因flhD敲除载体制备
[0010]本研究中用作细菌载体的菌株采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，已在文献中证明其安全性。利用Red同源重组法将鞭毛基因flhD敲除，得到细菌载体。
[0011]2.2表达靶向降解PCNA的融合蛋白质粒制备
[0012]蛋白序列在金斯瑞公司合成，收到后设计引物将目的片段E3LR
‑
PCNAtag进行PCR扩增，通过同源重组整合到线性化的质粒载体pUC57(带有Amp抗性)，导入大肠杆菌内扩增培养，提取的质粒即为目的质粒pUC57
‑
E3LR
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PCNAtag。
[0013]2.3目的质粒导入细菌载体制备
[0014]将2.2所述目的质粒pUC57
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E3LR
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PCNAtag利用电转化法导入2.1所述细菌载体中，通过Western Blot验证CD47拮抗蛋白表达情况，将能够正常表达蛋白的菌种扩增后计数，保藏于25％甘油中，于
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80℃冰箱贮存。
[0015]2.4小鼠肿瘤模型药效验证
[0016]将2.3制备的减毒菌株分别稀释至1
×
10^7、1
×
10^6、1
×
10^5三个浓度，另设计生理盐水(溶剂)对照组，进行剂量爬坡验证，筛选出药效最佳的剂量以及最大耐受剂量。
[0017]在安全范围内选取最佳药效剂量，与细胞周期小分子抑制剂CDK4/6抑制剂对照比较阻滞细胞周期的药效，通过流式细胞术等验证免疫细胞激活及浸润情况。
[0018]3.技术效果
[0019]本研究利用减毒沙门氏菌表达一种融合蛋白，能够招募E3泛素连接酶(E3 ligase)并特异性靶向增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，通过泛素
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蛋白酶体途径将PCNA降解。从而使得肿瘤细胞周期停滞，不再增殖，同时导致DNA损伤，激活cGAS
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STING信号通路，引起细胞免疫原性死亡，在肿瘤内部引起级联反应，促进机体对肿瘤的免疫杀伤。
四、具体实施方式
[0020]实施例1.表达靶向降解PCNA的融合蛋白的质粒载体制备
[0021]1.1目的基因扩增
[0022]目的片段在金斯瑞公司合成，设计上下游引物p1、p2。将含有目的质粒的菌液于10ml LB培养基中，37℃摇床过夜，用质粒小提试剂盒裂解菌体提取质粒。将质粒测定浓度后进行高保真PCR扩增，体系如下：高保真酶25μl；去离子水17μl；引物p1、p2各2μl；模板(目的质粒)4μl；总体积50μl。PCR循环参数：98℃预变性5min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30
个循环；72℃延伸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降解胞内肿瘤增殖蛋白的细菌，其特征是表达能够特异性结合胞内增殖蛋白的E3泛素化融合蛋白，增加细胞增殖蛋白的泛素化降解，阻断肿瘤细胞的增殖。2.根据权利要求1所述的细菌载体，其特征在于，所述细菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌，包括但不限于减毒李斯特菌、大肠杆菌等。3.根据权利要求1所述的细菌载体，其特征在于，所述细菌表达靶向降解PCNA的融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴锦慧，陈懿昀，许海恒，熊淑琴，
申请(专利权)人：无锡市南京大学锡山应用生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：