一种生产S-雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种利用黄浆水生产S

【技术实现步骤摘要】
一种生产S
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雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种利用黄浆水为原料生产S
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雌马酚的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]雌马酚属于非甾体雌激素组，具有S
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雌马酚和R
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雌马酚两种构型。S
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雌马酚构象上更接近于雌二醇，因此对雌激素受体具有高亲和力，而R
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雌马酚相对活性较低，值得注意的是在生物体内经过微生物转化产生的全部为S
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雌马酚。与前体大豆苷元相比，S
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雌马酚具有更强的抗氧化活性，并被证明具有血管舒张作用、神经保护作用以及防治骨质疏松。S
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雌马酚独特的生理活性使其可广泛应用于预防更年期综合征、神经退行性疾病防治等健康食品领域。
[0003]S
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雌马酚来源是肠道中特定的菌群转化大豆苷元得到，但是在亚洲只有不到50％，西方国家仅有小于30％的人可将大豆苷元转化为S
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雌马酚。目前雌马酚的生产主要通过化学合成和以大豆苷元为前体物质的细菌转化两种途径。化学法生产的是S
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雌马酚和R
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雌马酚的混合物且最高得率仅约31％，同时该路线需要使用昂贵的催化剂，并且反应过程步骤繁琐、易产生较多的副产物，分离纯化困难，导致化学合成的S
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雌马酚售价较高，且极易造成环境污染。而利用天然细菌发酵产生S
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雌马酚需要严格的厌氧环境，并且目前我国缺乏商业化的专利菌株。
[0004]与高成本的化学合成以及包含低效、高成本的植物提取和长周期的厌氧微生物转化两个过程的分离微生物转化相比，利用微生物细胞工厂合成S
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雌马酚具有绿色、低成本、代时短、外源基因表达量高和耐受氧的突出优势，是微生物合成S
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雌马酚的研究热点。以大肠杆菌为宿主的S
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雌马酚合成途径异源重构是目前合成S
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雌马酚的最有效的方式。然而，目前微生物合成S
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雌马酚所需的前体物质均为大豆苷元，其主要来源于豆科作物，自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，在大豆中的含量约为0.1％
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0.5％。提取的异黄酮大部分以糖苷形式存在，苷元型异黄酮含量小于5％，且异黄酮糖苷水解释放苷元配基需要酶解或强酸高温环境，成本高且容易造成环境污染。另外植物提取法还有两个重要的制约因素：(1)原料来源和产量上受季节性因素影响较大，同时我国大豆的对外依存度较高；(2)大豆中存在多种结构类似物，高纯度产品的提取成本较高。因此探索更丰富的大豆异黄酮原料来源对推广异黄酮及其活性衍生物的应用具有重要意义。
[0005]在豆腐压制成型过程中产生的副产物黄浆水中含有丰富的大豆异黄酮，每加工1吨大豆可排放出2～5吨黄浆水，大豆中大豆异黄酮的含量为0.05％～0.4％，约45％～50％的异黄酮流失到黄浆水中，同时黄浆水中还含有大量的蛋白质和碳水化合物。因此，黄浆水的大量排放一方面可造成大豆异黄酮等功能性物质的流失，另一方面由于其化学需氧量BOD和生物需氧量COD高，直接排放容易造成严重的环境污染。而黄浆水中98％的大豆异黄酮都是以糖苷型大豆异黄酮存在，而生物转化多以大豆苷元为底物合成S
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雌马酚。虽然糖苷类化合物可通过酶、微生物以及酸类物质进行转化，然而植物来源的β
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葡萄糖苷酶提取
纯化成本高、容易造成环境污染，同时具有高产β
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葡萄糖苷酶的野生型菌株不易获取。因此，常用基因工程菌表达外源β
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葡萄糖苷酶，但目前基因工程菌表达的β
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葡萄糖苷酶多是胞质酶，难以与胞外的大豆苷结合从而进行水解为大豆苷元。因此，难以通过在目前常用的大肠杆菌底盘细胞中表达β
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葡萄糖苷酶的方法将黄浆水中的大豆苷转化为大豆苷元进而通过S
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雌马酚合成途径转化为S
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雌马酚。黄浆水的主要碳源为蔗糖，葡萄糖和果糖含量极低，而常用的大肠杆菌底盘细胞对蔗糖的利用能力极低，无法在黄浆水中正常生长，如不赋予大肠杆菌利用蔗糖的能力，则需要额外添加葡萄糖等碳源，这又会增加S
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雌马酚的生产成本。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，即针对目前生物学方法生产S
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雌马酚的局限性，提供一种可将大豆苷高效转化为S
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雌马酚的S
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雌马酚基因工程菌。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述S
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雌马酚基因工程菌的构建方法。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述S
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雌马酚基因工程菌在利用黄浆水制备S
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雌马酚中的应用。
[0009]本专利技术的思路为：针对大肠杆菌底盘细胞无法将黄浆水中的大豆苷转化为大豆苷元，进而通过S
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雌马酚转化系统转化为S
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雌马酚的问题，以及大肠杆菌底盘细胞无法利用黄浆水中的蔗糖作为碳源的情况，通过挖掘并筛选来自于多个物种的糖苷转运系统，选择大豆苷高效转运蛋白，将大豆苷转运至大肠杆菌内，并进一步转化为大豆苷元；同时，在大肠杆菌中表达蔗糖酶，赋予大肠杆菌蔗糖利用能力，实现该工程菌在无需添加任何额外碳源的情况下，以黄浆水为原料的S
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雌马酚合成。而在大肠杆菌底盘细胞中导入可以降解蔗糖为葡萄糖的蔗糖酶后，其产生的葡萄糖由于存在葡萄糖抑制而影响大豆苷转运的情况，通过利用CRISPR
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Cas9技术敲除大肠杆菌葡萄糖转运蛋白，解除葡萄糖对大豆苷转运的抑制，以此来构建一种利用黄浆水为原料的S
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雌马酚基因工程菌，并在实际中应用。
[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0011]本专利技术提供了一种生产S
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雌马酚的基因工程菌，以大肠杆菌BL21为宿主，导入了编码大豆苷元到S
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雌马酚转化酶基因dznr、ifcA、ddr和tdr，过表达了糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和磷酸化β
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葡萄糖苷酶bglB基因，导入了编码β
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呋喃果糖苷酶的sacC基因，敲除了葡萄糖跨膜转运基因ptsG。
[0012]其中，所述的dznr基因来源于乳酸菌Lactococcus strain 20
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92，编码大豆苷元还原酶(DZNR)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的ifcA、ddr和tdr基因来源于Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006，其中，所述的ifcA基因编码二氢大豆苷元消旋酶(DDRC)，其核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产S
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雌马酚的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，导入了编码大豆苷元到S
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雌马酚转化酶基因dznr、ifcA、ddr和tdr，过表达了糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和磷酸化β
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葡萄糖苷酶bglB基因，导入了编码β
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呋喃果糖苷酶的sacC基因，敲除了葡萄糖跨膜转运基因ptsG。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的dznr基因来源于乳酸菌Lactococcus strain 20
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92，编码大豆苷元还原酶DZNR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的ifcA、ddr和tdr基因来源于Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006，其中，所述的ifcA基因编码二氢大豆苷元消旋酶DDRC，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的ddr基因编码二氢大豆苷元还原酶DHDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的tdr基因编码四氢大豆苷元还原酶THDR，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因和所述的磷酸化β
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葡萄糖苷酶bglB基因来源于大肠杆菌Escherichia coli JM109，其中，所述的糖苷型大豆异黄酮转运蛋白bglF基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，所述的磷酸化β
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葡萄糖苷酶bglB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的β
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呋喃果糖苷酶的编码基因sacC来源于产琥珀酸曼氏杆菌Mannheimia succiniciproducens，菌株号KCTC 0769BP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述的葡萄糖跨膜转运基因ptsG，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8。5.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)大豆苷元到S
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雌马酚重组质粒的构建：通过将dznr和ifcA、ddr和tdr基因分别克隆到pCDFDuet
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1、pETDuet
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1表达载体上，分别构建pCDFDuet
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dznr
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ifcA和pETDuet
‑1‑
ddr
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tdr重组质粒；(2)糖苷PTS转运系统重组质粒的构建：通过将bglF和bglB基因克隆到pACYCDuet
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1表达载体上，构建pACYCDuet
‑1‑
bglF
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bglB重组质粒；(3)蔗糖水解系统重组质粒的构建：将基因sacC组装到组成型启动子pCOLA...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏秀东，王喆，周剑忠，李晓楠，戴意强，许壮，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：