金黄色葡萄球菌新型肠毒素基因四重实时荧光PCR检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开金黄色葡萄球菌新型肠毒素基因四重实时荧光PCR检测试剂盒及方法。根据sel、sed、sem和seq基因序列分别设计引物和探针，采用blast分析扩增产物的序列特异性，以保证无同源或序列一致性生物基因信息，并充分考虑能否在同一体系中扩增四个靶基因的特异性序列，而进行精心优化和反复测试而获得本发明专利技术的检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明专利技术的方法对样品进行四重实时荧光PCR检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的金黄色葡萄球菌肠毒素SED、SEL、SEM和SEQ基因的特异性检测。因的特异性检测。因的特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌新型肠毒素基因四重实时荧光PCR检测试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种能同时检测金黄色葡萄球菌传统及新型肠毒素基因的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌极易污染乳制品、肉类、淀粉类等食品，是引起细菌性食物中毒的重要致病菌之一。研究表明葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxins，SEs)是引起金黄色葡萄球菌中毒的主要毒力因子。它们是一类结构相似、毒力相近的低分子量蛋白质，只需要高纳克至低微克数量级的肠毒素就可以特异性地攻击小肠细胞，进入消化系统造成腹泻、呕吐等肠道疾病。肠毒素一般具有很强的热稳定性，100℃处理30min后仍然具有活性，因此即使菌体在加工过程中已被杀死，其产生的肠毒素依然能引起食物中毒。到目前为止，已发现二十多种肠毒素和类肠毒素，并且这个数字还在继续扩增中。其中口服后能引起灵长类动物模型呕吐的超抗原被称为金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)，包括五种经典肠毒素SEA～SEE以及新型肠毒素SEG
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SEI，SEK～SET、SEY；而缺乏催吐活性或未经试验的肠毒素被称为金黄色葡萄球菌类肠毒素(Staphylococcal enterotoxin
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like proteins,SEls)，包括SElJ、SElU、SElV、SElW、SElX、SElZ。许多肠毒素编码基因具有连锁性，如肠毒素sed、selj、ser可同时存在于质粒pIB485上；sek和seq可串联存在于噬菌体和金黄色葡萄球菌毒力岛；同样定位于毒力岛上的还有肠毒素sec和sel；最常见的egc cluster可连锁表达seg、sei、sem、sen和seo5个肠毒素基因。
[0003]目前常用的肠毒素检测方法主要有分子生物学方法和免疫学方法。分子生物学方法主要是基于PCR技术建立的实验方法，具有灵敏、快速、简便等优势，特别是实时荧光PCR技术常被用于食品中各类毒素基因的检测。市面上没有针对新型肠毒素的核酸检测试剂盒，经典肠毒素SEA～SEE的核酸仅是单重的荧光PCR检测方法。曾有学者利用RT
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PCR反应成功检出sea～selj 9种肠毒素基因，但还没有实现一管多测，而且基因水平的检出并不意味着蛋白水平的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常用的基于抗原
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抗体特异性识别的肠毒素蛋白检测方法，但是食物基质中的复杂成分如磷酸酶、过氧化氢酶、被葡萄球菌A蛋白非特异性结合的IgG都会导致ELISA试剂盒灵敏度和特异性的降低以及假阳性反应的发生。肠毒素是一类结构极其相似的蛋白质，在ELISA检测过程中极易发生交叉反应。此外，目前已有的商品化试剂盒只能检测经典肠毒素SEA～SEE，缺乏新型肠毒素的蛋白检测技术。近几年陆续有报道指出新型肠毒素亦可参与食物中毒事件，新型肠毒素携带率很高，因此迫切需要建立新型肠毒素的检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个目的是为了克服上述现有技术的不足，提供了一种多重荧光PCR检测试剂盒，可在一个PCR反应中同时实现对4种金黄色葡萄球菌肠毒素的分型，并通过肠
毒素基因串联表达的现象，推测包括sec
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sel、sed
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selj
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ser、seg
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sei
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sem
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sen
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seo、sek
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seq这12种基因的检出情况。
[0005]为实现上述目的，本专利技术从GenBank下载金黄色葡萄球菌肠毒素基因sel、sed、sem、seq的碱基序列，然后进行同源比对分析，查找基因的保守区域。分别在保守核酸序列区域，设计特异引物和目标探针。引物序列如下表：
[0006]表1各引物序列
[0007][0008]本专利技术的第二个目的是一种非诊断目的的金黄色葡萄球菌新型肠毒素四重实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
[0009]a)对待测样品进行前处理；
[0010]b)提取待测样品中的菌体DNA，优选采用Promega基因组提取试剂盒(Lot:A1120)；
[0011]c)以步骤(b)中提取的菌体DNA2μl为模板，用优化建立的Taqman荧光PCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量Real
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timePCR检测；
[0012]d)反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样本的PCR扩增循环次数(Ct)值。按照建立的判读标准：Ct值为0或大于40表示阴性，Ct值小于38表示呈阳性；Ct值在38
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40之间，样本需要重新检测。根据各样本的Ct值研判样本中是否含有肠毒素基因。
[0013]反应体系如下：
[0014]表2PCR反应体系
[0015][0016]反应程序：95℃预变性2分钟，40个循环中95℃变性20秒，58℃退火45秒，并在退火阶段检测荧光。
[0017]所述dNTP Mixture为2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dGTP和2.5mM dTTP的混合
溶液。
[0018]步骤b)样本适用范围包括食品样本、粪便、呕吐物等标本。对于粪便、呕吐物标本，根据量的多少，用100
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200μl生理盐水悬浮、煮沸，10000rpm离心2分钟，取2μl上清液即可进行PCR反应。食品样本针对待测细菌的增菌液中增菌后，取1ml增菌液于10000rpm离心5分钟，弃上清，用Qiagen DNA提取试剂盒提取DNA，再取2μl进行PCR反应。
[0019]根据sel、sed、sem和seq基因序列分别设计引物和探针，采用blast分析扩增产物的序列特异性，以保证无同源或序列一致性生物基因信息，并充分考虑能否在同一体系中扩增四个靶基因的特异性序列，而进行精心优化和反复测试而获得本专利技术的检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本专利技术的方法对样品进行四重实时荧光PCR检测，在一次扩增反应中完成对待测样品的金黄色葡萄球菌肠毒素SED、SEL、SEM和SEQ基因的特异性检测，并通过肠毒素基因串联表达的现象，推测包括sec
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sel、sed
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selj
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ser、seg
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sei
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sem
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sen
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seo、sek
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seq这12种基因在待检样品中的检出情况。以本专利技术的检测引物及探针按照本专利技术的方法对样品进行四重实时荧光PCR检测，检测快速，8
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10小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强。
[0020]金黄色葡萄球菌极易污染奶粉、猪肉及糕点类食品，共培养后产生肠毒素，从而引起恶心、呕吐、腹泻等肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.金黄色葡萄球菌新型肠毒素四重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于包括肠毒素SED、SEL、SEM和SEQ基因检测引物及探针；所述肠毒素SED、SEL、SEM和SEQ基因检测引物及探针由以下构成：2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括TaKaRa耐热性DNA聚合酶、10
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ExTaqBuffer(Mg2+plus)、dNTPMixture。3.一种非诊断目的的金黄色葡萄球菌新型肠毒素四重实时荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤S1：对待测样品进行前处理；步骤S2：提取待测样品中的菌体DNA；步骤S3：以步骤S2中提取的菌体DNA2μl为模板，用优化建立的Taqman荧光PCR反应体系和反应条件，进行实时荧光定量Real
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timePCR检测；步骤S4：反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样本的PCR扩增循环次数Ct值；若Ct值为0或大于40表示阴性，Ct值小于38表示呈阳性；Ct值在38
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈琦，楼正青，
申请(专利权)人：杭州市中医院，
类型：发明
国别省市：