【技术实现步骤摘要】
一种肠道聚集性大肠埃希氏菌的鉴定方法
[0001]本专利技术涉及食品安全检测
,更具体的说是涉及一种肠道聚集性大肠埃希氏菌的鉴定方法。
技术介绍
[0002]肠道聚集性大肠埃希氏菌(EAEC),是一类引起人和幼畜腹泻的重要病原菌。EAEC易污染水或绿叶蔬菜,迅速确定EAEC的污染来源可有效缩小疫情的范围,而建立简便高效的EAEC检测方法是控制疫情的关键。
[0003]目前针对于EAEC的检测方法可分为3类:传统培养法、免疫学检测法和分子生物学法。传统培养法需要对EAEC进行分型培养以及生理生化鉴定,操作步骤繁琐且检测周期较长,一般需要4~7天。酶联免疫吸附技术和免疫层析技术是免疫学检测法的两个主要检测手段。免疫学检测法是基于EAEC菌体表面特异性抗原(O、H抗原)的不同,通过抗原抗体间特异性识别而达到鉴定的目的,操作简单快速,但其检测范围狭窄,只能检测特定血清型的EAEC,抗体制备成本高,且容易存在一定的假阳性率。分子生物学法主要依靠聚合酶链式反应技术对EAEC的标志性毒力基因aggR和pic进行识别。基于聚合酶链式反应技术的分子生物学法检测手段众多,可满足不同的实验需求,且检测技术效果好,特异性强,检出阳性率高,但大多数方法的检测结果判读依赖于荧光定量聚合酶链式反应仪,成本较高,不能直观地对结果进行判定。其他一些依赖于核酸电泳进行结果判定的检测技术虽然成本不高,但有些基因片段大小相近,导致无法准确辨别目的条带。
[0004]综上,如何提供一种灵敏度高、准确性好、检测时间短、操作简便的肠道聚集性 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肠道聚集性大肠埃希氏菌的鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)培养目标菌,提取目标菌全基因组DNA;(2)以提取的目标菌全基因组DNA为模板,进行多重不对称聚合酶链式反应,所需引物序列如下:aggR
‑
F:5
’‑
TGCCATCAACACAGTATATCCG
‑3’
;SEQ ID No.1;aggR
‑
R:5
’‑
AATACAGAATCGTCAGCATCAGC
‑3’
;SEQ ID No.2;pic
‑
F:5
’‑
AGCCGTTTCCGCAGAAGCC
‑3’
;SEQ ID No.3;pic
‑
R:5
’‑
AAATGTCAGTGAACCGACGATTGG
‑3’
;SEQ ID No.4;uidA
‑
F:5
’‑
GCGAGGTACGGTAGGAGTTG
‑3’
;SEQ ID No.5;uidA
‑
R:5
’‑
TCACAGCCAAAAGCCAGACA
‑3’
;SEQ ID No.6;并且所述uidA
‑
R的5
’
端标记地高辛,所述aggR
‑
R和pic
‑
R的5
’
端标记生物素;(3)采用带颜色的微球标记可识别uidA、aggR和pic目标基因的DNA序列,获得检测探针;(4)将链霉亲和素喷涂于硝酸纤维膜上作为aggR和pic目标基因检测线,将抗地高辛抗体喷涂于硝酸纤维膜上作为uidA目标基因检测线,制备检测试纸条;(5)将步骤(2)得到的不对称聚合酶链式反应产物与步骤(3)制备的检测探针混匀,之后利用步骤(4)制备的检测试纸条进行检测。2.如权利要求1所述的一种肠道聚集性大肠埃希氏菌的鉴定方法,其特征在于,所述步骤(2)的反应体系为:加入12.5μL PCR扩增预混液,引物混合液,1.0μL可疑单菌...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘道峰,黄艳梅,山珊,刘成伟,李芮,
申请(专利权)人:江西省疾病预防控制中心江西省结核病预防控制所,江西省食品安全风险评估中心,
类型:发明
国别省市:
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