一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合及其LAMP检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合及其LAMP检测方法和应用，引物组合包括：UreB引物组和CagA引物组；所述UreB引物组包括引物F3

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合及其LAMP检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子诊断的快速检测
，具体涉及一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合及其LAMP检测方法和应用。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种定植于胃黏膜形态呈螺旋形或弧形弯曲状的微需氧革兰氏阴性菌，世界上超过一半的人口长期被Hp感染。Hp持续感染会导致慢性胃炎，严重可演变为消化性溃疡、癌前病变(萎缩、肠上皮化生和发育不良)和胃癌。Hp感染是胃癌形成的主要因素，被世界卫生组织列为I类致癌因子，与未感染人群相比，感染Hp的人群患胃癌的风险增加了2
‑
8倍。大多数情况下，Hp感染为无症状，约10％的感染者出现胃部病变，其中1％
‑
3％的人会进展为胃癌。鉴于目前幽门螺杆菌缺少商业化疫苗且多重耐药性问题日益严重，临床上对其根除效果不佳，因此，精准的检测技术是预防幽门螺杆菌感染的关键，也是评估感染后治疗效果的重要手段。
[0003]目前临床上用于Hp的检测方法分为侵入性和非侵入性两大类，侵入性方法主要包括胃镜取胃粘膜组织进行免疫组化检测、细菌培养法、快速尿素酶试验(RUT,rapidurease test)及血清抗体检测等；非侵入性方法包括14C/13C呼气试验(14C/13C－UBT，14C/13Curea breath test)、唾液抗体、尿液抗体和粪便抗原检测(HpSA,Hp stool antigen)等。上述方法中不同程度存在操作复杂、检测滞后、灵敏度不高、有创伤等缺点，且无法识别细菌是否致病。因此，建立一种无创、快捷、准确的致病Hp检测方法是众多学者研究的目标。
[0004]精准的检测技术是根除幽门螺杆菌的基础，尽管传统检测技术众多，但在敏感性与特异性等诸多方面存在不足，在这些检测技术指导下的用药方案也导致诸多问题，如国内外研究均表明，近年来幽门螺杆菌的耐药率明显增加，且有产生多重耐药的趋势。因此，开发准确、简便的检测方法克服治疗过程中面临的问题迫在眉睫。所有的Hp都携带有尿素酶B基因(UreB)，但Hp的重要毒力因子细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated geneA,CagA)才是引起胃癌发生的关键因素，CagA+菌株引起胃癌发生风险高，而CagA
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菌株胃癌风险较低，因此，CagA基因被认为高毒力Hp菌株最重要的标志物。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合及其LAMP检测方法和应用，应用Hp通用基因UreB和致病基因CagA设计开发一款基于LAMP技术的Hp检测试剂，可实现快速、无创、精确鉴别检测感染Hp和感染致病性Hp，从而指导用药方案，降低由Hp感染造成的胃癌的发病率，也为全民自测Hp提供参考。
[0006]本专利技术采用下述的技术方案：
[0007]一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合包括：UreB引物组和CagA引物组；所述UreB引物组包括引物F3
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1、B3
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1、FIP
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1、BIP
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1、LooF
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1、LooB
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1；所述UreB引物组各引物序列依次见序列表序列号1
‑
6；所述CagA引物组包括引物F3
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6、B3
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6、FIP
‑
6、BIP
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6、LooF
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6、LooB
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6；
所述CagA引物组各引物序列依次见序列表序列号31
‑
36。
[0008]本专利技术还提供一种幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法，所述LAMP检测方法使用幽门螺杆菌双靶点的引物组合进行LAMP扩增。
[0009]进一步的，幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法包括:
[0010]S1:所述UreB引物组和CagA引物组分别与LAMP反应液配制成25μL反应体系，然后通过LAMP反应进行扩增；
[0011]S2:反应结束，通过肉眼观察反应体系颜色变化判断检测样品中是否含有幽门螺杆菌核酸物质和高毒力株幽门螺杆菌核酸物质。
[0012]进一步的，所述反应体系包括1.4mmol/LdNTP Mix、20mmol/LTris
‑
HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2SO4、6mmol/LMgSO4、0.1％Triton X
‑
100、320U/mL Bst DNA聚合酶、10μmol/L酸碱指示剂。
[0013]进一步的，所述LAMP反应条件为60
‑
65℃恒温30
‑
60min。
[0014]进一步的，所述反应体系用酸碱指示剂建立可视化检测系统；所述酸碱指示剂选自苯酚红、酚红、溴百里酚蓝、中性红、甲酚红、玫红酸中的一种。
[0015]进一步的，所述酸碱指示剂为苯酚红。
[0016]进一步的，所述步骤S2中UreB引物组反应体系为橙黄色且CagA引物组反应体系为橙黄色，则体系中含有高毒力幽门螺杆菌核酸物质；UreB引物组反应体系为紫红色且CagA引物组应体系为紫红色，则体系中既不含幽门螺杆菌核酸物质也不含高毒力幽门螺杆菌核酸物质；UreB引物组反应体系为橙黄色且CagA引物组应体系为紫红色，则体系中含有幽门螺杆菌核酸物质。
[0017]本专利技术还提供一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合在检测幽门螺杆菌和高毒力幽门螺杆菌试剂盒中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术提供的幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法用时短、反应快，30分钟就能出检测结果；本检测方法特异性高，能同时快速精确鉴别感染Hp和感染致病性Hp，为治疗方案的确定提供有效参考；本检测方法不需要昂贵器材，只需维持60℃即可完成检测，使检测更加便利；所用的LAMP检测方法费用低，从而降低检测成本，能够应用于通用型幽门螺杆菌和高毒力株幽门螺杆菌的检测试剂盒中。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本专利技术的一些实施例，而非对本专利技术的限制。
[0021]图1幽门螺杆菌UreB通用基因引物组合1
‑
4筛选结果；
[0022]图2幽门螺杆菌CagA毒力基因引物组合1
‑
4筛选结果；
[0023]图3 UreB引物组合反应温度筛选结果；
[0024]图4 CagA引物组合反应温度筛选结果；
[0025]图5 UreB引物组合反应时间筛选结果；
[0026]图6 CagA引物组合反应时间筛选结果；
[0027]图7 UreB引物组合LAMP特异性检测结果；
[0028]图8 CagA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌双靶点的引物组合，其特征在于，包括UreB引物组和CagA引物组；所述UreB引物组包括引物F3
‑
1、B3
‑
1、FIP
‑
1、BIP
‑
1、LooF
‑
1、LooB
‑
1；所述UreB引物组各引物序列依次见序列表序列号1
‑
6；所述CagA引物组包括引物F3
‑
6、B3
‑
6、FIP
‑
6、BIP
‑
6、LooF
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6、LooB
‑
6；所述CagA引物组各引物序列依次见序列表序列号31
‑
36。2.一种幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP检测方法使用权利要求1所述的幽门螺杆菌双靶点的引物组合进行LAMP扩增。3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，所述检测方法包括:S1:所述UreB引物组和CagA引物组分别与LAMP反应液配制成25μL反应体系，然后通过LAMP反应进行扩增；S2:反应结束，通过肉眼观察反应体系颜色变化判断检测样品中是否含有幽门螺杆菌核酸物质和高毒力株幽门螺杆菌核酸物质。4.根据权利要求3所述的一种幽门螺杆菌双靶点的LAMP检测方法，其特征在于，所述反应体系包括1.4mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保宁，陈昱作，唐智慧，符立法，刘人捷，周博彦，潘吉祥，王明辉，袁鑫，陈柯帆，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：