一种基于CRISPR技术检测甘薯G病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
ID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0014]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
‑
7任一所示。
[0015]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0017]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.8所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害。
[0019]在一个实施方式中，所述V型Cas蛋白选自以下任意一种：
[0020]I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0021]II、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2相比，在对应于SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第233位氨基酸存在突变。
[0022]在一个实施方式中，所述第233位氨基酸位点突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，S，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，所述第233位氨基酸突变为R。
[0023]应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。领域技术人员能够理解，本专利技术Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r
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DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
[0024]本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本专利技术Cas突变蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
[0025]本专利技术中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
[0026]术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如D233R表示第233位的D突变为R。
[0027]本专利技术所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2进行比对而确定的，譬如用Smith
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Waterman运算
法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searches ofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726
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730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝
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1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2进行比来确定本专利技术所述蛋白质内特定氨基酸的位置。
[0028]进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。
[0029]进一步的，所述方法还包括采用引物对进行扩增获得待测核酸的步骤。
[0030]所述引物对的上游引物如SEQ ID NO：9
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14任一所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：15
‑
20任一所示。
[0031]在一个实施方式中，所述引物对选自下组任意一种或其组合：
[0032]i、引物对的上游引物如SEQ ID No.9所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.15所示；
[0033]ii、引物对的上游引物如SEQ ID No.10所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.16所示；
[0034]iii、引物对的上游引物如SEQ ID No.11所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.17所示；
[0035]iv、引物对的上游引物如SEQ ID No.12所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.18所示；
[0036]v、引物对的上游引物如SEQ ID No.13所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.19所示；
[0037]vi、引物对的上游引物如SEQ ID No.14所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.20所示；
[0038]优选的，引物对的上游引物如SEQ ID NO：14所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：20所示。
[0039]本专利技术中，所述待测核酸可以是双链核酸，也可以是单链核酸。
[0040]本专利技术所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。
[0041]本专利技术中，所述样品可以为来自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘薯G病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯G病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
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30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
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7任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
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7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
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10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
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7任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
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5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
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7任一所示。2.一种检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、权利要求1所述的gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自以下I
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II任意一种：I、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；II、所述V型Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，赵莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：