呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学检测领域，具体涉及呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。本发明专利技术构建了检测呼吸道并病毒甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒的特异性的引物组及探针，通过配套的PCR体系，以熔解曲线和融链温度特征峰为指标实现了单色检测通道完成多种呼吸道病原菌的同时检测，将现有的荧光PCR检测通量增加至少一倍，其成本低，耗时少，极大的提升了检测效率，可广泛用于多病原体混合检测分析，其检测结果可进一步用于辅助临床诊断和治疗。结果可进一步用于辅助临床诊断和治疗。

【技术实现步骤摘要】
呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生化检测领域，具体涉及呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。常见的呼吸道病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒、冠状病毒、博卡病毒等。
[0003]在传统检测中，往往需要患者先抽血化验，但临床常规的生化指标分析无法对患者所感染的病原体种属做出准确鉴定，大多数临床治疗仍处于经验应用阶段，存在较大的盲目性。呼吸道病毒“金标准”是病毒的分离培养，一般病毒培养需要时间长，对实验室环境要求高，同时由于一些传染性和致病性强的呼吸道病毒，如寨卡病毒和人偏肺病毒等，在一般医院是无法进行培养，需要专业的机构才能进行。这种方法周期长、环境要求高，不仅耗费人力物力，对重症呼吸道感染患者来说还会延误宝贵救治时间，所以急需一种检测速度快、灵敏度高、结果准确呼吸道病毒检测方法，为快速检测、精准治疗提供一种有效的工具。目前市场上虽有一些检测呼吸道病原体的试剂盒，但是以单一靶标检测或分管检测为主，不能一次性检出多个病原菌，要检测多个靶标就需进行多次检测，耗时长，且检测流程不统一，操作复杂。
[0004]目前分子体外检测领域采用的技术主流是实时荧光PCR技术，但随着检测行业发展的需求，多基因、多病原体的检测变得越来越迫切，面对越来越复杂的复合性病原体感染的多靶点检测需求，多重PCR扩增以其高通量、高效率、低成本和少耗时的特性成为最理想和最快速的分子检测方法之一，但是在进行多重PCR扩增时，实验也不得不去面对新的问题，如现有的常用荧光定量仪器检测通道为4～5个，单管检测的靶基因数量一般也为4～5个，同时伴随体系中引物探针数目的增加，对引物探针的设计提出更高要求，这些因素都很大程度的影响多重实时定量PCR检测技术在检测领域的应用和推广。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供呼吸道病毒检测的荧光PCR试剂盒及检测方法。
[0006]本专利技术提供了引物探针组合，其包括：
[0007]用于检测检测甲型流感病毒的探针A和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
[0008]用于检测乙型流感病毒的探针B和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；和/或
[0009]用于检测呼吸道合胞病毒的探针C和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；和/或
[0010]用于检测副流感病毒1型的探针D和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；和/或
[0011]用于检测副流感病毒2型的探针E和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；和/或
[0012]用于检测副流感病毒3型的探针F和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或
[0013]用于检测人偏肺病毒的探针G和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0014]进一步的，本专利技术所述的引物探针组合还包括用于检测内标的探针H和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:23所示。
[0015]本专利技术所述的引物探针组合中，
[0016]所述探针的5
’
端连接荧光报告基团，3
’
端连接荧光淬灭基团；
[0017]所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种；
[0018]所述探针A～H中，任意两者为一组，同一组中两个探针的5
’
端荧光报告基团相同。在本专利技术的一些具体的实施例中，所述用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的探针的5
’
端荧光报告基团和3
’
端荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1；所述用于检测呼吸道合胞病毒和副流感病毒1型的探针的5
’
端荧光报告基团和3
’
端荧光淬灭基团分别为ROX和BHQ2；所述用于检测副流感病毒2型和副流感病毒3型的探针的5
’
端荧光报告基团和3
’
端荧光淬灭基团分别为和HEX和BHQ2；所述用于检测人偏肺病毒和内标的探针的连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为CY5和BHQ2；
[0019]进一步的，所述探针A～H中同一组的两个探针，任意一种的TM为60～75℃，另外1种探针的Tm值比检测同一呼吸道病原菌的引物组的Tm值低0～30℃。
[0020]本专利技术中，对于单色光通道同时进行两种病原菌检测，要求检测两种病原菌的探针的的Tm值不同，其中一条探针Tm值较高，优选TM值为60～75℃，另外1条探针Tm值检测同一呼吸道病原菌的引物组的Tm值低0～30℃。本专利技术针对单色光检测通道检测不同病原菌的引物组和探针进行了多次尝试，在本专利技术的对比例中，针对同一检测通道的病原菌的引物组和探针也按此要求设置，结果表明，并非简单将单靶点引物探针组合即可得到成功的多重检测体系。
[0021]本专利技术所述探针中，
[0022]探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
[0023]探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
[0024]探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
[0025]探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
[0026]探针E的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
[0027]探针F的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
[0028]探针G的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
[0029]探针H的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
[0030]本专利技术提供了所述的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测呼吸道病原菌的引物探针组合，其特征在于，包括：用于检测检测甲型流感病毒的探针A和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或用于检测乙型流感病毒的探针B和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；和/或用于检测呼吸道合胞病毒的探针C和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；和/或用于检测副流感病毒1型的探针D和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；和/或用于检测副流感病毒2型的探针E和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；和/或用于检测副流感病毒3型的探针F和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或用于检测人偏肺病毒的探针G和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测内标的探针H和引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5
’
端连接荧光报告基团，3
’
端连接荧光淬灭基团；所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的任意一种；所述探针A～H中，任意两者为一组，同一组中两个探针的5...

【专利技术属性】
技术研发人员：高歌，高利飞，曹雅倩，郑业焕，付光宇，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：