用于分析ApoE基因的SNP的实时检测用单核酸及利用其的检测方法技术

本发明专利技术涉及载脂蛋白E(ApoE，apolipoprotein E)基因的单核苷酸多态性实时检测用单核酸及利用其的检测方法。更详细地，涉及利用单核酸实时检测ApoE基因的单核苷酸多态性的方法及用于该方法的试剂盒，上述单核酸具有X

【技术实现步骤摘要】
用于分析ApoE基因的SNP的实时检测用单核酸及利用其的检测方法


[0001]本专利技术涉及用于分析载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因的SNP的实时检测用单核酸及利用其的检测方法。更详细地，涉及利用单核酸实时检测ApoE基因的单核苷酸多态性的方法及用于该方法的试剂盒，上述单核酸具有X
‑
Y
‑
Z的结构，并且由能够与112及第158个密码子中呈现单核苷酸多态性的ApoE基因的一部分或所有碱基序列互补结合的碱基序列构成。

技术介绍

[0002]就转基因而言，因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism；SNP)而引起的变形为最常见的形态，并成为导致各种疾病的原因(Barreiro LB,et al.,Methods Mol.Biol.,578:255
‑
276,2009；Beaudet L.et al.,Genome Res.,11(4):600
‑
608,2001)。对此，为了早期诊断出因转基因引起的各种疾病，通过SNP检测的诊断方法非常有效且可实现快速诊断。因此，已经提出了许多用于准确检测SNP的方法，并且至今还在进行着与之相关的许多研究(Ermini ML.et al.,Biosen.&Bioele.,61:28
‑
37,2014；K.Chang et al.,Biosen.&Bioele.,66:297
‑
307,2015)。
[0003]具体地，作为分析多个基因的最常用的方法，有使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法以及多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction，Multiplex PCR)方法。
[0004]上述聚合酶链式反应可与模板(template)DNA相结合，通过任意设计由荧光物质和猝灭物质结合而成的引物或探针，由此具有能够准确地仅扩增待检测的基因的所需位点的优点。但是，由于一次反应中只能扩增一个目的基因，因此具有待扩增的目的基因为多个时需要重复相同工作的麻烦。
[0005]上述多重聚合酶链式反应的优点在于，可在一个试管中进行多重聚合酶链式反应以同时分析多个基因区域。但是，随着在一个试管中同时使用多个引物或探针，在引物或引物之间发生交叉反应，因此一次可扩增的基因区域的数量受到限制。并且，寻找反应条件需要花费大量的精力和时间，并且具有无法从灵敏度及特异性获得较好的结果的缺点(Hardenbol P.et al.,Nat.Biotechnol.，21(6):673
‑
678，2003)。
[0006]近来，正在积极开展着通过使用通用引物来同时扩增多个基因区域而不使用多重聚合酶链式反应以实现大量分析的研究，作为代表性技术，有可同时分析多个基因区域的单核苷酸多态性(SNP)的SNPlex、Goldengate assay、分子倒置探针(molecular inversion probes；MIPs)等。
[0007]但是，上述SNPlex、Goldengate assay、分子倒置探针(molecular inversion probes；MIPs)等之类的方法，需要将在第一个试管中反应的生成物的一部分移至第二个试管中进行反应，或者需要利用各种酶，因此有可能发生不同样品之间的污染，具有实验方法复杂的问题。并且，由于仅可检测相当于附着有荧光标记的探针数量的单核苷酸多态性，因
此存在随着待分析的单核苷酸多态性的数量增多而导致分析费用增加的问题。
[0008]另一方面，载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因与apo C
‑
I、C
‑Ⅱ
及LDL受体基因相关联，据悉，基因多态性具有与高脂血症及痴呆等各种疾病的发病相关的关联性。
[0009]据报道，阿尔茨海默氏病患者的β
‑
淀粉样(β
‑
Amyloid)蛋白合成过程中起到分子介导作用，就ApoE e4而言，推测到这些结合介导特性较强，并且，ApoE e4因结合形态的差异导致磷酸化过程的变化，由此加快神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)的形成速度。
[0010]人体的ApoE基因位于第19个染色体的长臂，并存在3种对立基因2、3、4的同位型E2、E3、E4，这些因第112个及第158个氨基酸不同而区分。作为这些3种对立基因的组合，由6个不同基因型形成ApoE基因多态性(参照表7)，其多态性与心血管疾病及阿尔茨海默氏病的发病危险相关联。
[0011]其中，据悉，ApoE4蛋白是阿尔茨海默氏病和冠状动脉疾病的重要危险因子，ApoE2蛋白反而具有阿尔茨海默氏病的预防效果，反之，第Ⅲ型高胆固醇血症患者的大部分为ApoE2的同型接合体，ApoE基因的多态性在心血管疾病及痴呆有着重要意义，不仅对患者，而且对健康的一般人也被视为重要检查。
[0012]对此，长期以来，在实时检测基于ApoE基因的SNP的转基因的方面上，本专利技术人一直在研究可通过提高低灵敏度和特异性来简单而准确地诊断因ApoE转基因而诱发的疾病的方法，本专利技术人发现，当使用单核酸时，它们具有高灵敏度及高特异性，并且对诊断例如包括阿尔茨海默氏病及心血管疾病在内的因ApoE转基因引起的各种疾病非常有效，并完成了本专利技术。
[0013]【现有技术文献】
[0014]【非专利文献】
[0015](非专利文献0001)Barreiro LB，et al.，Methods Mol.Biol.，578:255
‑
276，2009
[0016](非专利文献0002)Beaudet L.et al.，Genome Res.，11(4):600
‑
608，2001
[0017](非专利文献0003)Ermini ML.et al.,Biosen.&Bioele.,61:28
‑
37,2014
[0018](非专利文献0004)K.Chang et al.,Biosen.&Bioele.,66:297
‑
307，2015
[0019](非专利文献0005)Hardenbol P.et al.，Nat.Biotechnol.，21(6):673
‑
678，2003

技术实现思路

[0020]本专利技术的一个目的在于，提供如下的ApoE基因的单核苷酸多态性检测用单核酸，其特征在于，上述单核酸：
ⅰ
)具有X
‑
Y
‑
Z的结构，
ⅱ
)与包含单核苷酸多态性位点的ApoE基因的一部分或所有碱基序列互补结合，
ⅲ
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ApoE基因的单核苷酸多态性检测用单核酸，所述单核酸：
ⅰ
)具有X
‑
Y
‑
Z的结构，
ⅱ
)与包含单核苷酸多态性位点的ApoE基因的一部分或所有碱基序列互补结合，
ⅲ
)在两个末端或内部附着能够探测的相同或至少2个不同的标记，iv)所述Y为由位于ApoE基因的1个或2个碱基序列构成的RNA，Y位点与单核苷酸多态性位点直接杂交，以便于探测ApoE基因的单核苷酸多态性(SNP)，并与ApoE基因杂交时，Y被切断试剂切断，就用于确认所述ApoE基因的单核苷酸多态性的1型单核酸而言，所述X为由4个至20个碱基序列构成的DNA，所述Z为由1个至20个碱基序列构成的DNA，当所述ApoE基因与单核酸杂交之后，Y被切断试剂切断时，X及Z也从ApoE基因分离，所述单核酸的特征在于，就用于确认所述ApoE基因的单核苷酸多态性的2型单核酸而言，所述X为由10个至30个碱基序列构成的DNA，所述Z为由1个至5个碱基序列构成的DNA，当所述ApoE基因与单核酸杂交之后，Y被切断试剂切断时，Z从ApoE基因分离，但X不从ApoE基因分离而用作引物及探针。2.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，单核酸由序列号3、4、5及6构成；或者由序列号7、8、9及10构成。3.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，用于确认ApoE基因的第112个密码子的单核苷酸多态性的1型单核酸的X为序列号27，或者是选自由以所述序列号27的碱基序列3
‘
末端为基准包含4个至19个碱基的序列号11至27的碱基序列组成的组中的任一个碱基序列。4.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，用于确认ApoE基因的第112个密码子的单核苷酸多态性的2型单核酸的X为序列号37，或者是选自由以所述序列号37的碱基序列3
‘
末端为基准包含10个至29个碱基的序列号17至37碱基序列组成的组中的任一个碱基序列。5.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，用于确认ApoE基因的第158个密码子的单核苷酸多态性的1型单核酸的X为序列号54，或者是选自以所述序列号54的碱基序列3
‘
末端为基准包含4个至19个碱基的序列号38至54的碱基序列组成的组中的任一个碱基序列。6.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，用于确认ApoE基因的第158个密码子的单核苷酸多态性的2型单核酸的X为序列号64，或者是选自以所述序列号64的碱基序列的3
‘
末端为基准包含10个至29个碱基的序列号44至64碱基序列组成的组中的任一个碱基序列。7.根据权利要求1所述的单核酸，其特征在于，用于确认ApoE基因的第112个密码子的单核苷酸多态性的1型单...

【专利技术属性】
技术研发人员：南泳铉，金楠孝，金显美，
申请(专利权)人：纽丽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：