用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，其主要结构为E1、S2和底物链。其中E1和S2为MNAzyme的组成部分，单一的任一部分均没有催化活性。底物链催化位点两侧修饰有荧光基团CY5和其猝灭基团BHQ

【技术实现步骤摘要】
用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器


[0001]本专利技术属于基因检测
，尤其涉及一种用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器

技术介绍

[0002]在人类基因组中，单碱基碱基突变几率约为1/1000。但是，它在许多疾病发生中都扮演重要角色，比如TP53，EGFR和RAS基因突变已经成为肿瘤标记物，而KRAS基因中发生单碱基基因突变则会改变激酶活性引发一系列恶性肿瘤。对于单碱基基因突变的检测，目前，基因测序或者定量PCR仍是最常用的策略。然而，这两种策略都存在耗时长，设备步骤复杂的缺点。尽管很多研究者对其做出了一定的改进而产生如依赖核糖核酸酶的定量PCR、引物阻断定量PCR和等位基因特异性定量PCR等方法，但他们仍然需要单独设计复杂的引物和探针。因此，开发一种快速简便的方法对单碱基基因突变进行精确检测对于快速诊疗突变相关的疾病显得尤为重要。
[0003]近年来，利用DNA碱基互补配对特性和核酸酶高效，特异性强等特点，很多学者设计出了一系列基于DNA和蛋白酶驱动的检测系统用于对单碱基基因突变进行检测。邹秉杰等人在其研究中，利用FEN1酶的剪切特性设计了一种DNA分子机器用于区分野生型和突变型DNA。吴曈勃等人利用APE1酶和核酸内切酶对单碱基基因突变进行检测。
[0004]尽管这些方法均有着快速准确的优势，但是使用蛋白酶的为体系注入了许多不确定因素，主要表现在以下几个方面：
[0005](1)蛋白酶本身难以保存而且容易因为外界刺激而失活。
[0006](2)使用细胞内缺失的蛋白酶会阻塞体系在细胞内的应用潜力。
[0007](3)高纯度蛋白酶价格昂贵，限制了体系的广泛应用。
[0008]脱氧核酶(DNAzyme)作为一种有催化活性的单链DNAzyme为检测单碱基基因突变开辟了一条新道路。作为一种单链DNA，DNAzyme不会因为外界高温而失活。其次，单链DNA的制备简便且易于修饰，因此可以将设计成本进一步压缩。此外，相比于蛋白质酶或者RNA酶而言，DNAzyme在生理条件下拥有更高的稳定性和生物相容性。这些优点使其在生物化学，分析化学或某些交叉学科等领域有着广泛的应用前景。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种基于多组分脱氧核酶(MNAzyme)的生物传感器，用于单碱基基因突变的检测，以解决传统蛋白酶检测方法抗干扰性能低，费用昂贵等问题。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，包括E1、S2和底物链(后文简称sub)，E1和S2是MNAzyme的主要组成部分，E1和S2均依次含有识别臂序列、催化核心序列和底物链结合臂序列，S2的识别臂较短，为9个碱基，E1的识别臂较长，为13个碱基，S2识别臂序列中含有单碱基突变识别位点，单碱基突变识别位点用于区分突变型目标物(后文简称
MT)和野生型目标物(后文简称WT)，E1和S2的识别臂序列应与突变型目标物完全互补配对，而S2的识别臂序列和野生型目标物无法杂交，sub是MNAzyme的催化目标物，其序列中包含一个RNA
‑
A位点，若干脱氧核苷酸骨架，荧光基团和猝灭基团，荧光基团和猝灭基团修饰在RNA
‑
A位点两侧，sub左右两侧和MNAzyme的底物链结合臂完全杂交。
[0012]优选地，单碱基突变识别位点为S2识别臂序列中3
’
端第4
‑
6个碱基。
[0013]具体地，E1 DNA序列为：DNA序列为：其中识别臂序列(单横线部分)为TTCTGATAAGCTA，催化核心序列为CGGTCGAA，底物链结合臂序列(双横线部分)为
[0014]S2 DNA序列为：其中，其中底物链结合序列(双横线部分)为催化核心序列为TCCGAGC，识别臂序列(单横线部分)为ACAAATTCG。具体地，单碱基突变识别位点为S2识别臂序列ACAAATTCG中的AAT中的任一个。
[0015]sub DNA序列为：GAGCGACTCACTAT rA GGAAGAGATG，其中，荧光基团嵌入靠近rA的两个AA之间的磷酸框架上，猝灭基团连接在靠近rA的T上，GAGCGACTCACTAT与E1的底物链结合臂序列完全杂交，GAAGAGATG与S2的底物链结合序列完全杂交。当所述荧光基团为CY5，猝灭基团为BHQ
‑
2时，sub DNA结构为：
[0016]GAGCGACTCACTA/iBHQ2dT//rA/GGA/iCy5/AGAGATG。
[0017]MT DNA序列为：CGAATTTGTTAGCTTATCAGAA，
[0018]WT DNA序列为：CGAAATTGTTAGCTTATCAGAA。
[0019]应当理解，MT、WT为证明该体系可行的特定序列。该设计具备通用性，可通过更改识别臂序列实现对不同目标物的检测。
[0020]具体地，所述荧光基团为CY5，猝灭基团为BHQ
‑
2。
[0021]用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器的检测原理为：
[0022]经过特殊设计的多组分核酶(MNAzyme)由E1、S2、sub三链组成，其主要组成为识别臂、催化核心和底物臂。其中用于识别目标物的识别臂被拆分为一长一短两部分，并将检测位点设定在较短识别臂上。底物臂用于捕获底物链进行催化。底物链的催化位点两端修饰有荧光基团和其对应的猝灭基团。当突变型DNA存在时，其与识别臂完全杂交，催化核心将被激活将底物链切割为一端修饰荧光基团的DNA链和另一端修饰猝灭基团的DNA链，荧光基团和猝灭基团远离，引发荧光恢复。MNAzyme在底物链切断后将完全解体，释放出突变型目标物进行下一轮反应实现信号放大。当检测野生型DNA时，由于识别臂长度经过特殊设计，在一定温度范围内单个碱基的改变将破坏识别臂和野生型目标物的杂交，因此两侧的催化核心无法被链接为一个整体进而激活其活性，不会观察到荧光恢复。相比于传统单碱基基因突变的检测方法，该方案基于纯DNA构建，没有使用任何外加蛋白酶作为催化剂，有着使用方便，检测快捷，成本低廉，储存容易等优势。
[0023]用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器制备方法具体包括以下步骤：
[0024]将E1、S2和sub混匀，置于95℃下退火5min，并置于37℃下杂交30min组成MNAzyme，所述E1、S2和sub的摩尔比为1:1:1。
[0025]用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器使用方法包括以下步骤：
[0026]取已配置好的MNAzyme，加入待检测样品和Tris
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HCl缓冲液，置于37℃反应4h，反应完成后检测其荧光强度，激发光设定为633nm，收集650
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850nm处的发射光强度，记录665nm左右的最强发射光强度，以WT为对照，若本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，其特征在于，包括E1、S2和底物链sub，E1和S2均依次含有识别臂序列、催化核心序列和底物链结合臂序列，E1的催化核心序列为CGGTCGAA，E1的底物链结合臂序列为ATAGTGAGTCGCTC，S2的底物链结合序列为CATCTCTTC，S2的催化核心序列为TCCGAGC，E1的识别臂序列比S2的识别臂序列长，S2识别臂序列中含有单碱基突变识别位点，单碱基突变识别位点用于区分突变型目标物MT和野生型目标物WT，sub DNA序列为：GAGCGACTCACTAT rA GGAAGAGATG，其中，荧光基团和猝灭基团修饰在rA两端。2.根据权利要求1所述的用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，其特征在于，S2的识别臂包括9个碱基。3.根据权利要求1所述的用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，其特征在于，单碱基突变识别位点为S2识别臂序列中第4
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6个碱基。4.根据权利要求1所述的用于检测单碱基基因突变的MNAzyme生物传感器，其特征在于，所述荧光性基团为CY5，猝灭基团为BHQ

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志灵，张轩豪，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：