通过环状cDNA扩增鉴定基因融合的方法技术

一个实施方式提供了通过产生cDNA环并通过扩增或测序来分析环状cDNA以鉴定已知和未知基因融合的方法。环状cDNA以两种方法产生：1)将靶RNA逆转录为cDNA，将cDNA的3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过环状cDNA扩增鉴定基因融合的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月19日提交的美国临时专利申请No.62/974,193的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。


[0003]本专利技术的方面涉及核酸测定领域，并且特别涉及生物样品中存在的特定靶核酸的扩增和检测。

技术介绍

[0004]基因融合或易位是引起各种遗传疾病的染色体异常之一。与其他类型的突变不同，基因融合不显示“热点”特征，并且每种情况具有不同的融合基因伴侣或在不同外显子处具有不同断裂点的相同融合伴侣。检测融合基因的常用方法包括荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链反应(PCR)。这些方法需要从已知融合基因设计的引物或探针。然而，在许多情况下，基因可具有多种融合伴侣，例如已知白血病中的MLL基因具有超过150种鉴定的融合伴侣和可能许多未知的融合伴侣。此外，每个融合伴侣具有不同的断裂点。设计用于鉴定所有这些伴侣的探针或引物将很困难。长距离反向PCR(LDI
‑
PCR)方法是允许使用来自已知基因的引物鉴定未知融合的替代方法。该方法仅限于双链DNA，其依赖于靶基因和融合基因中的限制性内切酶切割位点。该方法产生大量用于分析的非融合环，长距离PCR将导致扩增和测序失败。这些局限限制了该方法的临床应用。
[0005]最近，下一代测序(NGS)已用于分析基因融合；然而，NGS方法涉及许多步骤，其增加了分析的复杂性，并且还可产生人工结果。NGS方法对于融合分析是耗时、昂贵且效率较低的。r/>[0006]融合伴侣的鉴定将是疾病诊断、治疗监测和药物开发的有用标志物。然而，没有方法可以在短时间内用简单的测试来分析这些融合伴侣。
[0007]因此，本专利技术的一个目的是提供一种可以在简单测试中分析任何已知或未知融合伴侣的有效方法。
[0008]专利技术概述
[0009]一个实施方式提供了通过产生cDNA环并通过扩增或测序分析环状cDNA来鉴定已知和未知基因融合的方法。环状cDNA以两种方法产生：1)将靶RNA逆转录为cDNA，将cDNA的3
’
末端连接到其5
’
末端以形成环状cDNA，或2).将靶RNA的3
’
末端连接到其5
’
末端以形成环状RNA，将环状RNA逆转录为cDNA，并连接cDNA以形成环状cDNA。使用从野生型靶基因的已知序列设计的引物扩增环状cDNA。扩增环状cDNA中已知或未知的融合基因序列并通过测序分析鉴定。
[0010]另一个实施方式提供了富集含有基因的环状cDNA的方法。该方法包括设计与环状cDNA的野生型序列互补的引物。引物含有核酸内切酶识别序列，并且引物在野生型环状cDNA内形成核酸内切酶切割位点。核酸内切酶切割野生型环状cDNA，但不切割含有环状DNA
的融合。未切割的环cDNA的扩增和测序分析将表明存在已知或未知的基因融合。
[0011]附图的简要说明
[0012]图1A
‑
1C是显示融合mRNA的逆转录和环状cDNA形成的图。图1A显示了没有基因融合的环状cDNA。图1B显示了具有3
’
末端基因融合的环状cDNA。图1C显示了具有5
’
末端基因融合的环状cDNA。图1D显示了从RNA环形成环状cDNA。
[0013]图2A
‑
2D是显示通过使用环状切割引物切割环状cDNA的图。图2A显示了没有融合基因的环状cDNA的切割。图2B显示了没有切割具有3
’
末端融合的环状cDNA。图2C显示了没有融合基因的环状cDNA的切割。图2D显示了没有切割具有5
’
末端融合的环状cDNA。
[0014]图3A
‑
3D是显示环状cDNA扩增的图。图3A显示了通过滚环扩增对3
’
末端融合的扩增。图3B显示了通过滚环扩增对5
’
末端融合的扩增。图3C显示了通过反向PCR对3
’
末端融合的扩增。图3D显示了通过反向PCR对5
’
末端融合的扩增。图4是实施例中使用的核酸序列的列表。图5A是荧光对时间(分钟)的曲线图，其显示了使用ABL1R
‑
引物(
▲
)、Bcr R
‑
引物(*)和对照的滚环扩增的结果。图5B是显示通过反向PCR扩增的凝胶照片。
[0015]图6是显示含有融合的cDNA富集的凝胶照片。
[0016]专利技术详述
[0017]I.定义
[0018]术语“核酸”是指RNA、DNA或和RNA
‑
DNA嵌合体。
[0019]术语“RT”是指逆转录。
[0020]术语“RT酶”是指可以使用RNA作为模板来合成cDNA的酶，包括但不限于M
‑
MuLV逆转录酶和AMV逆转录酶。
[0021]术语“引物”是指DNA或DNA
‑
RNA嵌合体的片段，其含有与靶基因互补的序列并用于逆转录或扩增。
[0022]术语“RT引物”是指用于逆转录的引物。
[0023]术语“野生型基因或序列”是指不含有突变或基因融合序列的基因或序列。
[0024]术语“5
’
末端融合”是指位于靶基因5
’
末端的基因融合伴侣。
[0025]术语“3
’
末端融合”是指位于靶基因的3
’
末端的基因融合伴侣。
[0026]术语“部分”是指用于标记或修饰RNA、DNA或dNTP的分子，并且包括但不限于生物素、地高辛、蛋白质标签、酶、核酸片段。
[0027]II.检测基因融合
[0028]一个实施方式公开了检测靶基因中已知和未知基因融合伴侣的方法。靶基因可以是RNA或DNA，优选地靶基因是mRNA。设计RT引物用于靶mRNA的逆转录以合成cDNA。引物具有与靶mRNA的3
’
末端或mRNA的poly A尾互补的序列。在一些实施方式中，引物是DNA或RNA或DNA
‑
RNA嵌合体。在一个实施方式中，引物具有至少6个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引物是一种或一组引物。当使用多个引物时，引物与靶基因的不同区域或不同外显子互补。在一些实施方式中，用一个或多个部分修饰引物，其可用于鉴定、分离、连接、扩增和测序。在一些实施方式中，引物含有至少两个部分，序列特异性部分和接头部分。序列特异性部分与靶基因互补，并且接头部分含有一个或多个序列，用于鉴定、分离、扩增和测序。在一些实施方式中，该方法包括将一种或多种RT引物与靶基因杂交以形成DNA
‑
RNA双链体，其中杂交的位置位于靶mRNA的3
’
末端的外显子中或poly A尾。在一些实施方式中，该方法包括
酶促延伸RT引物以合成cDNA链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.检测已知和未知基因融合的方法，其包括：a.提供与靶核酸的3
’
末端或poly A尾的序列互补的RT引物；b.将RT引物与靶核酸杂交以形成DNA
‑
RNA双链，其中所述RT引物与所述靶核酸的3
’
末端或poly A尾的序列互补；c.通过RT酶促合成cDNA；d.将所述cDNA的3
’
末端连接至其5
’
末端以形成环状cDNA；e.提供环切割引物，所述环切割引物具有与RT引物下游的靶cDNA的非融合序列互补的序列，其中所述引物含有可被核酸内切酶识别和切割的序列；f.将所述环状切割引物与所述环状cDNA中怀疑具有基因融合的区域杂交，以形成核酸内切酶切割位点；g.用核酸内切酶切割非融合环状cDNA；h.使用滚环扩增或PCR方法扩增未切割的环状cDNA；i.通过扩增或扩增产物的测序分析来检测基因融合。2.检测已知和未知基因融合的方法，其包括：a.将mRNA的3
’
末端连接至其5
’
末端以形成环状mRNA；b.将RT引物与所述环状mRNA杂交以形成DNA
‑
RNA双链；c.通过逆转录延伸所述RT引物以合成cDNA；d.将所述cDNA的3
’
末端连接至其5
’
末端以形成环状cDNA；e.将环状切割引物与所述环状cDNA中怀疑具有基因融合的区域杂交以形成核酸内切酶切割位点，其中所述环状切割引物具有与RT引物下游的靶cDNA的非融合序列互补的序列，并且所述引物含有被核酸内切酶识别的序列；f.用核酸内切酶酶促切割非融合环状cDNA；g.使用滚环扩增或PCR方法扩增未切割的环状cDNA；以及h.通过扩增或扩增产物的序列分析来检测基因融合。3.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述靶核酸包含RNA或DNA。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述引物包含DNA或DNA
‑
RNA嵌合体并且具有至少6个或更多个核苷酸。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述引物能够是一种引物或一组引物。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中用一种部分修饰所述引物，其目的是分离、连接扩增、测序和检测。7.根据权利要求6所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：X，
申请(专利权)人：XBF有限责任公司，
类型：发明
国别省市：