一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因及检测方法，他的核苷酸序列如序列表Seq ID No:4

【技术实现步骤摘要】
一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因及检测方法


[0001]本专利技术涉及一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因及检验方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]多年来，病原体感染严重危害人类健康，已广泛引起科学家及临床专家的关注。迄今为止，抗生素使用仍是临床上最主要的病原菌治疗手段。而病原菌的鉴定，对于使用何种抗生素具有重要的指导意义。早先已有研究表明，早使用合适的抗生素，将显著降低病人的死亡率。目前临床最传统的检测方法是对病人的样本进行培养，根据培养后的结果进行菌种鉴定。然而，在实际操作中，细菌的培养程序繁琐，耗时较长，通常需要2～5天；该过程对环境要求高，避免样本被其他菌种污染；同时，培养过程中，部分菌种有可能会因培养不当而受到抑制，导致漏检的情况。因此，提高病原体的检测速度和精准度十分迫切。
[0003]表皮葡萄球菌是滋生于生物体表皮的革兰氏阳性菌，因呈葡萄串状而得命。其为条件致病菌，通常发生于院内感染。近年来，越来越多的研究发现，表皮葡萄球菌常与大量的医疗器械的使用有关，是产生导管、人工瓣膜等植入物相关感染的主要致病菌。表皮葡萄球菌的感染通常是亚急性或慢性，可引起毛囊炎、麦粒肿等表皮软组织的感染；也能导致中耳炎、肺炎、心包炎等内脏器官感染；甚至产生化脓性感染，最终导致败血症，发展呈危及生命的病状。对于临床医生而言，急需快速准确获取病原学信息从而及时合理地开展抗菌治疗，尤其是面对发展为重症的病患，针对性的抗生素治疗能够有效改善患者的临床表征，增加救治率。然而，目前的临床传统的培养法还远远不能满足临床诊断和治疗的需要。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为了克服现有技术中病原体的检测时长和精度差的问题，本专利技术提供一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因及检测方法，本专利技术提高表皮葡萄球菌检测的精确度，并极大缩短表皮葡萄球菌的检测时间，为临床快速精准用药提供技术支持。
[0005]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因，他的核苷酸序列如序列表Seq ID No:4
‑
Seq ID No:10中任一序列的至少一部分，或其互补序列。
[0007]优选的：进行qPCR扩增时，扩增的引物位于特异性核酸片段内部，包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。
[0008]优选的：进行qPCR扩增时，扩增产物的至少部分序列作为特异性探针，其包括SEQ IDNO：3所示的序列。
[0009]一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因的检验方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1，从临床样本中提取总DNA，其中含表皮葡萄球菌的基因组DNA；
[0011]步骤2，以步骤1提取获得的DNA为模版，与特异性引物、特异性探针结合，得到混合液，扩增引物中正向引物为SEQ ID NO：1；所使用的扩增引物中反向引物为SEQ ID NO：2；特
ID NO：4
‑
10中。
[0029]根据上述的表皮葡萄球菌特异性核苷酸序列，可有效地应用于从各类临床样本中快速鉴定是否存在表皮葡萄球菌物种。例如，可根据检测结果中是否存在表皮葡萄球菌特异性核酸片段，判断病人是否受到表皮葡萄球菌感染。在检测过程中，可以检测特异性核酸片段的全长或部分。
[0030]实时荧光定量PCR技术
[0031]早先培养法是微生物病原体鉴定的传统方法，也是鉴定的金标准。随着核酸扩增技术的出现，改变了微生物病原体的诊断方式，使之进入分子诊断时代。尤其是具有耐高温特性的DNA聚合酶的发现与应用，使PCR技术成为微生物病原体诊断最常用的方式之一。其以目的片段为模版，利用特异性引物进行扩增，通过多轮循环获得大量目的片段用于后续物种鉴定。该技术操作简单，灵敏度高，可弥补传统培养法中容易漏检、误检的缺陷，对于生长周期较长、培养条件苛刻或生化反应特点不典型的病原微生物检测至关重要。
[0032]实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real
‑
time PCR，qPCR)，能够对样本中的DNA或者RNA进行绝对定量或相对定量。在扩增反应中，测定每一次循环的荧光信号强度，根据最终的产物情况，推导模版的数量，即目标DNA或RNA的含量。qPCR检测方法包括SYBR Green法和TaqMan探针法。SYBR Green法的原理是：SYBR Green是能够特异地嵌合到DNA双链的荧光染料，因而PCR扩增过程中，双链的数量和荧光信号强度正相关，从而推测起始的核酸数量。该方法操作简单，但是特异性较低，且容易受引物二聚体影响。TaqMan探针法是合成一段特异性与目的序列反向互补的短序列，它的5
’
端和3
’
端分别带有荧光基团和淬灭基团。探针与目的序列结合，随着PCR扩增过程，DNA聚合酶的核酸外切酶活性将探针进行切割，荧光素游离在体系内，激发荧光。此时荧光强度与DNA数量正相关。探针法较SYBR Green特异性更高，且不受引物二聚体影响。本文故而采用TaqMan探针法检测表皮葡萄球菌特异核酸片段。
[0033]在本专利技术中，我们利用生物信息学方法筛选得到了表皮葡萄球菌的种内特异性DNA序列。根据这些序列，我们设计并合成了用于特异性识别表皮葡萄球菌的引物和TaqMan探针。最终，基于特异性引物和探针的检测工具，可实现快速的表皮葡萄球菌检测，而无须繁琐的临床培养过程。本专利技术可解决临床对于快速鉴定病原菌的需求，有望提高诊疗水平。
[0034]在本文的一些实施方案中，利用TaqMan探针法来对病原体特异性核酸片段进行检测，由于需要引物与目标DNA互补配对结合、探针与目标DNA互补配对结合，该检测方法进一步增加了检测的特异性。
[0035]本专利技术中提及的核酸序列如下：
[0036]SEQ ID NO：1正向引物
[0037]TTCTTGTATCAATTCTTCTGGGCTT
[0038]SEQ ID NO：2反向引物
[0039]TCCGTGTATTGGTAGCTTTCTTAAT
[0040]SEQ ID NO：3探针序列
[0041]TCCGTCAGGTGGAGCTGTGAGAGGCAC
[0042]SEQ ID NO：4表皮葡萄球菌特异性片段
[0043]GTACTTTTGTCAATGACAATTAGTGTTTTTCCAACGATTTTTTGTAGTGTATTTTTATATCTTTCCCAT
ATTCTTGTATCAATTCTTCTGGGCTTAAATAAATCTTTTCTAAATATAATCCGTCAGGTGGAGCTGTGAGAGGCACATTATTTCTATTTTTGTCCTCTAAGAGCTTAGGGACGTCATTAGGTTCACGCTTTCCTTTTCCTACTTCAATTAAGAAAGCTACCAATACACGGACCATATTATAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因，其特征在于：他的核苷酸序列如序列表Seq ID No:4
‑
Seq ID No:10中任一序列的至少一部分，或其互补序列。2.根据权利要求1所述表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因，其特征在于：进行qPCR扩增时，扩增的引物位于特异性核酸片段内部，包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。3.根据权利要求1所述表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因，其特征在于：进行qPCR扩增时，扩增产物的至少部分序列作为特异性探针，其包括SEQ ID NO：3所示的序列。4.一种如权利要求1所述表皮葡萄球菌的病原体特异性核酸基因的检验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，从临床样本中提取总DNA，其中含表皮葡萄球菌的基因组DNA；步骤2，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，唐瑶，王赛男，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：