一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法。与现有技术相比，没有采用正相色谱柱，以正己烷、异丙醇/乙醇作为流动相体系来测定对映异构体；而是采用表面涂敷纤维素

【技术实现步骤摘要】
一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法


[0001]本专利技术涉及药物分析
，具体涉及一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法。
[0002]醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N
‑
乙酰
‑3‑
(2
‑
萘)
‑
D
‑
丙氨酰
‑
p
‑
氯
‑
D
‑
苯丙氨酰
‑3‑
(3
‑
吡啶基)
‑
D
‑
丙氨酰
‑
L
‑
丝氨酰
‑
L
‑
酪氨酰
‑
N5
‑
氨甲酰
‑
D
‑
鸟氨酰
‑
L
‑
亮氨酰
‑
L
‑
精氨酰
‑
L
‑
脯氨酰
‑
D
‑
丙氨酰胺醋酸盐。
[0003]其结构式为：
[0004][0005]可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
[0006]因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
[0007]目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素
‑
三(3，5
‑
二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液
‑
乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的分析方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的一种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
[0009]实现上述专利技术目的的技术方案是：
[0010]本专利技术提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法，包括以下步骤：
[0011](1)样品配制：
[0012]供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
[0013]对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
[0014]灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
[0015]系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
[0016](2)色谱条件设置：
[0017]色谱柱：硅胶表面涂敷有纤维素
‑
三(4
‑
甲基苯甲酸酯)手性固定相为色谱柱；
[0018]流动相：以5mmol/L醋酸铵溶液(乙酸调节pH至4.5)为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
[0019]柱温：20～30℃；
[0020]流速：0.3～1.0ml/min；
[0021]进样体积：1～10μl；
[0022]检测波长：260～270nm；
[0023](3)检测和计算：
[0024]精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
[0025]根据本专利技术实施方案所述稀释剂为乙腈溶液。
[0026]根据本专利技术实施方案按照下表进行梯度洗脱：
[0027][0028]根据本专利技术实施方案，柱温为20～30℃；例如：20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃，优选为25℃。
[0029]根据本专利技术实施方案，流速为0.3～1.0ml/min；例如：0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，优选为1.0ml/min。
[0030]根据本专利技术实施方案，进样体积为1～10μl；例如：1μl、3μl、5μl、7μl、9μl、10μl；优选为10μl。
[0031]根据本专利技术实施方案，检测波长为260～270nm；例如：260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为264nm。
[0032]根据本专利技术实施方案，所述保护氨基酸为Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
OH。
[0033]本专利技术还提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法用于测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，所述保护氨基酸为Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
OH，其对应异构体的含量不高于0.3％。
[0034]本专利技术的有益效果是：
[0035]1、本专利技术采用的流动相是为醋酸铵和乙腈，为常用缓冲盐和极性试剂，很少与样品会发生反应，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中未使用三氟乙酸和甲酸等酸性添加剂，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
[0036]2、本专利技术对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如酪氨酸，Fmoc
‑
Tyr(tBu)
‑
Tyr(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
β
‑
Ala
‑
Tyr(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
β
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品配制：供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（2）色谱条件设置：色谱柱：硅胶表面涂敷有纤维素
‑
三（4
‑
甲基苯甲酸酯）手性固定相为色谱柱；流动相：以5mmol/L醋酸铵溶液（乙酸调节pH至4.5）为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；柱温：20~30℃；流速：0.3~1.0ml/min；进样体积：1~10
µ
l；检测波长：260~270nm；（3）检测和计算：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵娴，汤婷婷，芮美琪，张倩颖，沙向阳，
申请(专利权)人：南京锐志生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：