一株烟草脉斑驳病毒的应用制造技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及一株烟草脉斑驳病毒的应用。本发明专利技术的技术方案是一株烟草脉斑驳病毒的应用，使用烟草脉斑驳病毒侵染植物，烟草脉斑驳病毒核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1183～10715位所示。将TVMV58的病毒序列插入到pLXB载体中，构建形成了适用于在植物上进行农杆菌侵染的侵染性克隆，方便在植物上进行稳定的病毒侵染研究。本发明专利技术还证明了TVMV58变异株系具有交叉保护作用，能够保护植物免受同属其它病毒(马铃薯Y病毒和TuMV芜菁花叶病毒)的侵染，具有更广谱的抗病毒作用。具有更广谱的抗病毒作用。具有更广谱的抗病毒作用。

【技术实现步骤摘要】
一株烟草脉斑驳病毒的应用


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及一株烟草脉斑驳病毒的应用。

技术介绍

[0002]现有的植物病毒烟草脉斑驳病毒(TVMV)的侵染性克隆构建技术多采用限制性内切酶的酶切和连接技术或者基于多片段的Gibson克隆重组技术。侵染性克隆构建成功后可用于植物病毒与寄主互作相关的基础研究，还可用于筛选具有交叉保护作用的弱毒株系。虽然目前已有TVMV野生型的侵染性克隆构建的报道，但采用的侵染性克隆构建方法与本专利技术的方法不同。关于TVMV侵染性克隆的应用尚未见报道。在TVMV侵染性克隆构建与应用中存在以下问题：(1)由于TVMV病毒序列构建到植物双元表达载体后的序列较大。扩增病毒序列和克隆操作均有一定难度。(2)构建成功的含有TVMV病毒的质粒载体转入植物体内后，病毒往往不能够成功侵染。(3)筛选和构建具有交叉保护作用的病毒株系需做大量研究工作，同时难度很大。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题是为烟草脉斑驳病毒的应用提供一种新选择。
[0004]本专利技术的技术方案是一株烟草脉斑驳病毒的应用，使用烟草脉斑驳病毒侵染植物给植物提供交叉保护，烟草脉斑驳病毒核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1183～10715位所示。
[0005]进一步的，所述植物为烟草。
[0006]具体的，所述交叉保护的其他病毒为马铃薯Y病毒和/或TuMV芜菁花叶病毒。
[0007]本专利技术还提供了烟草脉斑驳病毒侵染性克隆载体，烟草脉斑驳病毒的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1183～10715位所示。
[0008]本专利技术的有益效果：在TVMV病毒的3
’
UTR末端插入58nt
‑
AU序列后，形成的变异病毒TVMV58。TVMV58侵染症状减轻，但病毒积累量与野生型的TVMV无显著差异。将TVMV58的病毒序列插入到pLXB载体中，构建形成了适用于在植物上进行农杆菌侵染的侵染性克隆，方便在植物上进行稳定的病毒侵染研究。本专利技术还证明了TVMV58变异株系具有交叉保护作用，能够保护植物免受同属其它病毒(马铃薯Y病毒和TuMV芜菁花叶病毒)的侵染，具有更广谱的抗病毒作用。
附图说明
[0009]图1、烟草脉斑驳病毒变异株侵染性克隆pLXB
‑
TVMV58的构建；
[0010]A.弱毒烟草脉斑驳病毒(TVMV
‑
58)的基因组结构和克隆策略；以pLX
‑
TVMV(TVMVwt)侵染克隆为模板，组装了两个跨越TVMV基因组和pLX骨架的cDNA片段，其中包括58nt AT
‑
rich片段。(红、绿、橙箭头)表示所使用的PCR引物；
[0011]B、C.通过琼脂糖凝胶PCR获得片段；
[0012]D.从选定的大肠杆菌菌落中纯化质粒的PCR扩增图，标记的DNA大小显示在右边；
[0013]E.右侧显示了XbaI酶切片段的大小；
[0014]注：wt为野生型；PCR为聚合酶链式反应。pLXB
‑
backbone:pLXB背景。
[0015]图2、TVMV58侵染性克隆在本氏烟上的侵染症状；
[0016]A.将pLX
‑
TVMV(TVMVwt)和pLX
‑
TVMV58(TVMV58)的侵染性克隆进行农杆菌转化，通过农业渗透法传递给本氏烟；在注射后14天(dpi)拍摄TVMVwt和TVMV58的症状。18天后收集数据，以未处理的健康植株作为对照；
[0017]B.使用抗TVMV外壳蛋白(CP)的Western blot检测未接种叶片上部的病毒积累，rubisco条带作为对照；
[0018]注：dpi为接种后天数；Western blot为蛋白质印迹法；rubisco为酮糖
‑
1,5
‑
二磷酸羧化酶。Healthy:健康植株；Loading control:加样对照。
[0019]图3、TVMV58继代培养后病的的稳定性分析；
[0020]A.TVMV58转化为农杆菌并注射本氏烟，12天后取上部发病叶片，摩擦接种到健康的本氏烟叶片上，进行传代培养；TVMVwt作为对照；
[0021]B.使用病毒特异性的CP抗体进行Western blot检测未接种叶片上部的病毒积累。Rubisco条带作为对照。注：Healthy:健康植株；Loading control:加样对照。
[0022]图4、病毒变异株TVMV58对TuMV和PVYros的交叉保护作用；
[0023]A.TVMV58转化农杆菌并注射本氏烟，14天后机械接种TuMV
‑
GFP和PVYros，处理后12天观察症状的模式图；
[0024]B、C.使用病毒特异性的CP抗体进行Western blot检测未接种叶片上部的病毒积累。Rubisco条带作为对照；
[0025]注：Healthy:健康植株；Loading control:加样对照；dpi,days post inoculation,即接种后的天数；symptom observation:症状观察。
具体实施方式
[0026]实施例1TVMV58侵染性克隆载体的构建
[0027]将野生型的TVMV病毒序列克隆到pLXB背景的载体中，构建成pLXB
‑
TVMV(TVMVwt)侵染性克隆。为了在TVMVwt的3
’
非编码区末端引入了58nt
‑
AU片段，(图1A)以pLXB
‑
TVMV质粒(质粒构建过程见参考文献Zhao M.,Garc
í
a,B.,Gallo,A.Tzanetakis,I.Sim
ó
n
‑
Mateo,C,Garc
í
a,JA.Pasin F.Home
‑
made enzymatic premix and Illumina sequencing allow for one
‑
step Gibson assembly and verification of virus infectious clones.Phytopathol Res 2,36(2020).https://doi.org/10.1186/s42483
‑
020
‑
00077
‑
4)DNA为模板，设计特异性引物。引物序列如下：pLXB
‑
TVMV58
‑
F：ggaattgttgattttgtgatgactg，pLXB
‑
TVMV58
‑
R：caagattactaaagtgtttcattatc，58rich
‑
F：gataatg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株烟草脉斑驳病毒的应用，其特征在于，使用烟草脉斑驳病毒侵染植物给植物提供交叉保护，烟草脉斑驳病毒核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1183～10715位所示。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述植物为烟草。3.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明敏，王海娟，赵健，孙振琪，岳建英，周洪友，王东，东保柱，张荠丹，法比奥，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：