一种防风转基因毛状根培养方法技术

本发明专利技术公开了一种防风转基因毛状根培养方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的培养方法包括：S1.将防风种子消毒后培养，长成防风无菌苗；S2.将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；S3.将转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，OD值为0.6

【技术实现步骤摘要】
一种防风转基因毛状根培养方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种防风转基因毛状根培养方法。

技术介绍

[0002]防风[Saposhnikovia divaricata(Trucz.)Schischk.]是我国重要的药用植物，以未抽薹干燥的根入药，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风等。历代本草记载认为山东、河南、湖北北部等地为防风主要产地，但现今防风产地主要是内蒙古、东北三省等地。防风主要的活性成分有升麻素苷、升麻素、5
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O
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甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等。防风中所含有的色原酮类成分是其发挥药效作用的主要物质基础，也是防风主要的次生代谢产物。近些年，人们发现有限的天然资源难以满足日益增长的医药及研发需求，而且长期对野生资源的采挖必然破坏生态平衡，导致天然资源的枯竭。植物组织培养技术繁殖速度快、稳定，并且以其独特优势应用于药用植物资源保护。其中毛状根、不定根培养技术是获得药用植物次生代谢产物的重要途径。
[0003]因此，提供一种防风转基因毛状根培养方法，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，提供一种防风转基因毛状根培养方法，利用含有表达载体pCAMBIA2301的K599农杆菌侵染防风无菌苗，诱导防风无菌苗得到防风毛状根，得到的防风毛状根均具有较高的生物量和色原酮含量。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供的一种防风转基因毛状根培养方法，包括以下步骤：
[0007]S1.制备外植体：将防风种子消毒后，接种于培养基中，培养长成防风无菌苗，得到外植体；
[0008]S2.制备发根农杆菌：将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；
[0009]S3.制备转基因侵染液：将S2的转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，当OD值为0.6
‑
1.0时，转基因侵染液制备完成；
[0010]S4.防风毛状根的诱导
[0011]在外植体的叶片上剪出伤口并放置于制备好的转基因侵染液当中,侵染后，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，而后将外植体用无菌水冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中除去杂菌，外植体伤口处陆续长出白色毛状根，待毛状根长到2～3cm，从叶片伤口处切下放入液体培养基中，摇床、遮光继代培养。
[0012]本专利技术的部分实施方案中，S1中的培养基为MS固体培养基；
[0013]优选地，消毒后的防风种子于培养基中培养20～40天，长成防风无菌苗。
[0014]本专利技术的部分实施方案中，S2中，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒通过冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞；
[0015]优选地，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞后，在含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB固体培养基上进行阳性筛选，挑取单克隆并提取质粒DNA，引物为：F
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2301AGAACCGACGACTCGTCCGT、R
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2301TCACACGTGGTGGTGGTGGT，通过PCR鉴定获得转基因发根农杆菌K599；
[0016]优选地，PCR反应程序为：95℃预变性5min，按95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min的程序进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min。
[0017]本专利技术的部分实施方案中，S3中，将转基因发根农杆菌K599接种到含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB液体培养基中，在摇床28
±
2℃条件下培养2
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3d，得到活化好的转基因发根农杆菌K599；
[0018]优选地，将活化好的转基因发根农杆菌K599刮取下来并用1/2MS培养基重悬，使其OD值为0.6
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1.0，转基因侵染液制备完成。
[0019]本专利技术的部分实施方案中，所述YEB固体培养基中，卡那霉素含量为40～60mg/L，链霉素含量为40～60mg/L；优选地，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L；
[0020]所述YEB液体培养基中，卡那霉素含量为40～60mg/L，链霉素含量为40～60mg/L；优选地，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L。
[0021]本专利技术的部分实施方案中，S4中，外植体在转基因侵染液当中的侵染时间为5～20min，优选为10min；
[0022]或/和所述含有Cef的固体MS培养基中，Cef的含量为40～60mg/L，优选为50mg/L。
[0023]本专利技术的部分实施方案中，S4中，液体培养基包括1/2MS液体培养基、MS液体培养基和B5液体培养基；优选为1/2MS液体培养基。
[0024]本专利技术的部分实施方案中，S4中，继代培养时，每7d更换一次培养基，共培养14
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35d；培养条件为24
±
2℃，130r/min。
[0025]本专利技术的部分实施方案中，还包括转基因毛状根的PCR鉴定，具体步骤为：挑取诱导出的毛状根，提取DNA，进行PCR检测，鉴定基因包括rolB和GUS基因。
[0026]本专利技术的部分实施方案中，PCR检测所用引物为：
[0027]rolB
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F：GCCAGCATTTTTGGTGAACT
[0028]rolB
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R：CTGGCCCATCGTTCTAAAAA
[0029]GUS
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F：ACCGGTGTCGCAATATCTTC
[0030]GUS
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R：TCCAGGATGAGCGATTTACC
[0031]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0032]本专利技术设计科学，构思巧妙，首次通过含有pCAMBIA2301质粒的K599农杆菌诱导防风毛状根，建立了防风的转基因毛状根体系。通过PCR检测，表明空载体基因已转入毛状根中。
[0033]采用本专利技术方法培养出的防风转基因毛状根，其生长良好，培养35d时其生物量增加了21倍左右，并具有较高的色原酮含量。本专利技术防风转基因毛状根遗传转化体系的建立，为后续探究防风毛状根功能性基因提供了支撑。
附图说明
[0034]附图1为本专利技术的防风转基因毛状根生过过程图；其中a为防风无菌苗的培养、b和c为农杆菌K599侵染防风叶诱导产生毛状根的情况、d为毛状根在固体培养基生长情况、e、f为毛状根在1/2MS液体培养基生长情况、g为液体培养基培养的毛状根(鲜)、h为烘干后的毛状根。
[0035]附图2为本专利技术三个株系的毛状根生长情况图，其中a为ZA株系、b为ZB株系、c为ZC株系。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备外植体：将防风种子消毒后，接种于培养基中，培养长成防风无菌苗，得到外植体；S2.制备发根农杆菌：将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；S3.制备转基因侵染液：将S2的转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，当OD值为0.6
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1.0时，转基因侵染液制备完成；S4.防风毛状根的诱导在外植体的叶片上剪出伤口并放置于制备好的转基因侵染液当中,侵染后，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，而后将外植体用无菌水冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中除去杂菌，外植体伤口处陆续长出白色毛状根，待毛状根长到2～3cm，从叶片伤口处切下放入液体培养基中，摇床、遮光继代培养。2.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S1中的培养基为MS固体培养基；优选地，消毒后的防风种子于培养基中培养20～40天，长成防风无菌苗。3.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S2中，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒通过冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞；优选地，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞后，在含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB固体培养基上进行阳性筛选，挑取单克隆并提取质粒DNA，引物为：F
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2301 AGAACCGACGACTCGTCCGT、R
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2301 TCACACGTGGTGGTGGTGGT，通过PCR鉴定获得转基因发根农杆菌K599；优选地，PCR反应程序为：95℃预变性5min，按95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min的程序进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min。4.根据权利要求3所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S3中，将转基因发根农杆菌K599接种到含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB液体培养基中，在摇床28
±
2℃条件下培养2
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3d...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠明，西芸霏，王立岩，王云贺，王研，孙卓，杨利民，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：