用于校准流通池中核酸文库接种效率的方法技术

本公开提供了用于校准流通池中多核苷酸接种效率的方法。接种效率的方法。接种效率的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于校准流通池中核酸文库接种效率的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求2020年7月2日提交的美国临时申请序列号63/047,817的优先权，其公开内容以引用方式并入本文。


[0003]本公开提供了用于校准流通池中多核苷酸接种效率的方法。

技术介绍

[0004]用于测序的流通池是含有小流体通道的载玻片，聚合酶、dNTP和缓冲液可以通过流通池进行循环。通道内部的玻璃修饰有与靶标核酸上的接头序列互补的短寡核苷酸。将含有接头的靶标核酸进行稀释并与这些寡核苷酸杂交，以将单个的DNA链暂时固定到流通池上(“多核苷酸接种”)。然后，使用例如利用引物延伸循环和这之后进行的化学变性的“桥式PCR”策略对文库链进行扩增。通过原位扩增方法将上述链扩增数千。将靶标核酸以低摩尔量(6pM至20pM)与流通池杂交。这会使DNA模板链之间产生较大的物理分离。在扩增结束时，将小簇相同的DNA保留为固定在2D表面上的分子，该分子可以全体经过测序。

技术实现思路

[0005]流通池中的多核苷酸接种效率通常是对最终簇数进行计数来确定。本公开提供了一种用于确定流通池中多核苷酸接种效率的改进的新方法。
[0006]本公开提供了一种评估在流通池中的多核苷酸接种效率的方法，该方法包括：将多核苷酸接种到流通池中，时长为至少1分钟，以及(i)使该流通池与结合到或掺入到接种的多核苷酸上带标记的剂进行接触，并且确定该流通池中存在的标记量，从而确定该接种效率；或者(ii)收集上清液；通过使用步骤(a)或(b)定量该上清液中的该多核苷酸：(a)使用定量聚合酶链反应(qPCR)和/或微滴式的聚合酶链反应(PCR)扩增该上清液中的该多核苷酸；或者(b)使用第二流通池再次对该上清液进行接种，并且在该多核苷酸进行桥式扩增后对生成的簇进行计数；以及(c)通过对该上清液中定量的多核苷酸的数量与用于接种流通池的多核苷酸的数量进行比较，确定该流通池的接种效率。在一个实施方案中，该带标记的剂包括通过聚合酶掺入到接种的多核苷酸上的带标记的dNTP。在另一实施方案中，该带标记的剂包括与接种的多核苷酸上的互补寡核苷酸结合的带标记的纳米颗粒或带标记的树枝状体。在另一实施方案中，该带标记的剂包括针对接种的多核苷酸带标记的接头或带标记的互补寡核苷酸。在另一实施方案中，该带标记的剂包括从接种的多核苷酸的末端生长出的带标记的结构。在另一或另外的实施方案中，该标记为可检测的发光或荧光标记。
[0007]在一个实施方案中，该方法通过观察未在表面上捕获而保留在本体接种溶液中的多核苷酸来确定接种效率。通过在接种过程结束时收集并分析来自流通池通道的上清液，可以确定有关该接种过程的更详细的信息。本文公开的方法尤其适用于检查图案化的流通池中的接种，其中，簇数不与接种的多核苷酸的数量直接相关，原因在于但不限于(1)多克
隆性、(2)之前的扩增复制物和(3)阱之间的空隙区域处的文库吸附。
[0008]在具体实施方案中，本公开提供了一种评估在流通池中的多核苷酸接种效率的方法，该方法包括：将多核苷酸接种到流通池中，时长为至少1分钟，以及收集上清液；通过使用步骤(a)或(b)定量该上清液中的该多核苷酸：其中，(a)包括：使用定量聚合酶链反应(qPCR)和/或微滴式的聚合酶链反应(PCR)扩增该上清液中的该多核苷酸；或者，(b)包括：使用第二流通池再次对该上清液进行接种，并且在该多核苷酸进行桥式扩增后对生成的簇进行计数；以及通过对该上清液中定量的多核苷酸的数量与用于接种流通池的多核苷酸的数量进行比较，确定该流通池的接种效率。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，对流通池的一个通道的多核苷酸接种效率进行评估。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，对流通池的一个以上通道的多核苷酸接种效率进行评估。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该流通池包括结合到该流通池的表面的多个引物。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该结合的引物包括具有SEQ ID NO:1序列的P5引物和/或具有SEQ ID NO:2序列的P7引物。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该多个引物随机结合到该流通池的表面。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该多个引物结合到该流通池的特定区域。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该多个引物结合到在该流通池表面上形成图案的阱阵列的表面。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该流通池用于下一代测序装置。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该多核苷酸包括接头。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该接头与桥式PCR相容。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该多核苷酸包括DNA文库。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，该DNA文库是使用文库制备试剂盒生成的。在本文公开的任何实施方案的另一实施方案中，根据包括以下步骤的方法制备该DNA文库：(A)使用转座体将引物同时片段化以及添加到隔离的DNA中；(B)通过缩短循环的PCR扩增该片段化的DNA，其中，该PCR扩增引物包含索引和接头序列；以及(C)洗涤并混合扩增的DNA片段以形成DNA文库。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该转座体链接到磁珠上。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该DNA文库生成自与人类受检者隔离的基因组DNA。在本文公开的另一或另外的实施方案中，将该多核苷酸接种到该流通池中，时长为5分钟至60分钟。在本文公开的另一或另外的实施方案中，将该多核苷酸接种到该流通池中，时长为10分钟至40分钟。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该qPCR包括使用双链结合染料，该双链结合染料使双链扩增产物能够基于荧光水平进行定量。该双链结合染料的示例包括但不限于绿色I染料、BRYT染料、PicoGreen染料、YOYO
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1碘化物染料和金色染料。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该qPCR包括用荧光报告子标记的序列特异的探针和与DNA模板结合的淬灭剂分子。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该淬灭剂分子为吸收多个波长上的光并且不发射光的深色淬灭剂。深色淬灭剂的示例包括但不限于Dabsyl、Black Hole Quenchers、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、IRDye QC
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1和Qxl淬灭剂。在本文公开的另一或另外的实施方案中，用于对该上清液中的该多核苷酸进行定量的该第二流通池不同于该接种了多核苷酸的流通池。在本文公开的另一或另外的实施方案中，该第二流通池每次运行提供最高至12Gb的序列数据，而该接种了多核苷酸的流通池每次运行提供最高至120Gb的序列数据。在本文公开的另一或另外的实施方案中，使用接种了相同浓度的多核苷酸但具有不同接种时长的流通池多次执行该方法。在本文公开的另一或
另外的实施方案中，在各个时间点以定时的方式对具有多核苷酸的流通池的接种效率进行评估。
[0009]在某个实施方案中，本公开提供了一种本文公开的方法的用途，该用途用于建设具有提升的多核苷酸接种效率的流通池的表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种评估在流通池中的多核苷酸接种效率的方法，所述方法包括：将多核苷酸接种到流通池中，时长为至少1分钟，以及(i)使所述流通池与结合到或掺入到接种的多核苷酸上带标记的剂进行接触，并且确定所述流通池中存在的标记量，从而确定所述接种效率；或者(ii)收集上清液；通过使用步骤(a)或(b)定量所述上清液中的所述多核苷酸：(a)使用定量聚合酶链反应(qPCR)和/或微滴式的聚合酶链反应(PCR)扩增所述上清液中的所述多核苷酸；或者(b)使用第二流通池再次对所述上清液进行接种，并且在所述多核苷酸进行桥式扩增后对生成的簇进行计数；以及(c)通过对所述上清液中定量的多核苷酸的数量与用于接种所述流通池的多核苷酸的数量进行比较，确定所述流通池的接种效率。2.根据权利要求1所述的方法，其中，对流通池的一个通道的多核苷酸接种效率进行评估。3.根据权利要求1所述的方法，其中，对流通池的一个以上通道的多核苷酸接种效率进行评估。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流通池包括结合到所述流通池的表面的多个引物。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述结合的引物包括具有SEQ ID NO:1序列的P5引物和/或具有SEQ ID NO:2序列的P7引物。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述多个引物随机结合到所述流通池的表面。7.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述多个引物结合到所述流通池的特定区域。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多个引物结合到在所述流通池表面上形成图案的阱阵列的表面。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流通池用于下一代测序装置。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸包括接头。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述接头与桥式PCR相容。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸包括DNA文库。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述DNA文库是使用文库制备试剂盒生成的。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述DNA文库根据包括以下步骤的方法制备：(A)使用转座体将引物同时片段化以及添加到隔离的DNA中；(B)使用缩短循环的PCR扩增所述片段化的DNA，其中，所述PCR扩增引物包含索引和接头序列；以及(C)洗涤并混合扩增的DNA片段以形成DNA文库。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述转座体链接到磁珠。16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述DNA文库生成自与人类受检者隔离的基因组DNA。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述多核苷酸接种到所述流通池...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴怡萱，F，
申请(专利权)人：伊鲁米纳公司，
类型：发明
国别省市：