一种低偏向的单精子全基因组扩增方法技术

本发明专利技术属于生殖遗传领域，涉及一种低偏向的单精子全基因组扩增方法。具体公开了一种低偏向的单精子全基因组扩增方法，本申请利用异种杂交配子发育初期的细胞卵裂快速同步复制DNA的特性，同时通过监控其中细胞周期的进程选取分裂末期的胚胎，最后结合其他常规体外全基因组扩增方法，完成完整高效的低偏向的单精子基因组扩增。与传统方法相比，该方法获得的扩增产物具有高全基因组覆盖度（>92%），极高的一致性和可靠性，这也使得对复杂物种的单精子分析成为可能。分析成为可能。

【技术实现步骤摘要】
一种低偏向的单精子全基因组扩增方法


[0001]本专利技术属于生殖遗传领域，涉及一种低偏向的单精子全基因组扩增方法。

技术介绍

[0002]单精子基因组测序是在单细胞水平对精子全基因组高通量测序的一项技术，是研究精子发生、染色体重组规律，精确分子育种，及生殖遗传相关疾病诊断的重要手段。1、对单个精子分离的实验操作技术要求较高：人工显微操作挑取或流式细胞仪分选容易造成多细胞或细胞损伤等问题。2、由于每个精子中只包含痕量DNA(pg级)，所以全基因组的预扩增是单细胞测序的关键。然而，目前常用的方法包括基于PCR扩增的简并寡核苷酸引物PCR(DOP
‑
PCR)，基于恒温扩增的多重置换扩增反应(MDA)、引物酶全基因组扩张(pWGA)，结合恒温与PCR扩增的多次退火环状循环扩增技术(MALBAC)等。由于这些方法都是指数级的扩增，因此它们往往存在偏向性、不均一性、不准确性、覆盖率低等问题。最近一种基于转座酶插入的线性扩增的方法(LIANTI)虽然极大的优于之前那些基于指数扩增的方法，但是其仍然有很多限制，比如实验操作复杂，可重复性不高，无法区分等位等。更重要的是目前这些方法从根本上都极易造成外源DNA污染，需要极高的实验条件和操作要求。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种低偏向的单精子全基因组扩增方法，实现对单精子基因组的高通量测序分析。该方法操作简单，突破了传统扩增的思维方式，获得了良好的扩增测序效果。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0005]由于单精子中DNA为痕量，同时大规模扩增，会导致偏向性，不均一性，容易出现错误，以及外源污染等的问题，申请人考虑到自然界生物体自身的DNA复制具有极高保真性和完整性的特点，因此利用杂交手段，借助胚胎发育早期卵裂在体内复制待测精子的基因组的方式，最后通过测序，获得了单精子全基因组。
[0006]一种低偏向的单精子全基因组扩增方法，包括：将待测物种的单精子中的DNA人工标记后，将该精子与不同物种的卵子杂交，杂交后选取512胞或其之前的胚胎，待细胞同步进入有丝分裂中期或末期时，进行DNA取样，测序，与待测物种的全基因组序列进行比对，即可获得单精子全基因组序列。
[0007]以上所述的方法中，优选的，所述的待测物种为鲫鱼，卵子提供物种为斑马鱼；
[0008]以上所述的方法中，优选的，所述的人工标记的方式是通过向单精子注射体外合成的h2a
‑
gfp mRNA来人工标记DNA。
[0009]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0010]1.本专利技术的方法通过选取512胞之前的胚胎(1000胞开始细胞出现不同步复制的现象)，同时所有细胞同步进入有丝分裂中期或末期(此时DNA复制都已完成)，进行后续体外扩增，与传统方法相比，该方法获得的扩增产物具有高全基因组覆盖度(>92％)，大大提
高了单细胞基因组扩增的可靠性，保真性，均一性和样品的一致性。
[0011]2.不会造成多细胞混样，并且几乎完全避免了外源基因组污染。
[0012]3.待测物种的精子如果是非整倍体或包含复杂基因组，本方法可以利用卵子的基因组对全基因组扩增产物进行质检。
附图说明
[0013]图1为杂交细胞中均处于有丝分裂中期或后期时染色单体的状态。
[0014]图2为银鲫和彩鲫的基因组DNA扩增结果质量检测；
[0015]其中：DrxCa表示彩鲫和斑马鱼的杂交胚胎，DrxCg表示银鲫和斑马鱼的杂交胚胎。
[0016]图3为杂交胚胎和自交胚胎的发育不同时期的形态比较。
[0017]图4为流式细胞仪测定不同有丝分裂时期胚胎的细胞DNA含量情况。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例对本专利技术技术方案做出更具体的说明：本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本专利技术以鲫鱼和斑马鱼杂交为例进行说明，其它物种也可进行精卵杂交以获得单精子的全基因组信息。
[0019]实施例1：
[0020]鲫鱼的单精子基因组测序，包括以下步骤：
[0021]本实施例所用的鲫鱼为四倍体彩鲫和六倍体银鲫
[0022]1.合成DNA标记物
[0023]用MAXIscript
TM KIT(Thermo Fisher)合成人H2a
‑
gfp mRNA，并使用进行定量。
[0024]2.杂交胚胎DNA标记
[0025]人工挤出成熟的斑马鱼卵和彩鲫/银鲫精液在塑料培养皿授精，然后立即在显微镜下用管尖极细(0.1至0.5μm)的玻璃微量注射针将约2nl H2A
‑
GFP mRNA(100ng/ul)注射入受精卵的动物极中，将培养皿放入26摄氏度培养箱培养。
[0026]3.细胞选取
[0027]在荧光显微镜下观察胚胎，当杂交胚胎发育至256细胞时期(约2.5小时)，且所有细胞均处于有丝分裂中期或后期时(图1，两组姐妹染色单体整齐的排列在细胞中或开始分离)，立即用注射器针头除去卵壳和卵黄，将剩下的动物极细胞用10微升枪头吹打入1微升磷酸盐平衡生理盐水(PBS)溶液中，放入液氮中速冻，然后将样品于
‑
80℃保存。
[0028]4.MDA扩增
[0029]使用单细胞全基因组扩增试剂盒(REPLI
‑
g Single Cell Kit，Qigen)将取好的样品进行全基因组多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)，得到扩增产物。
[0030]5.扩增质量检测
[0031]随机选取斑马鱼一个单拷贝基因作为分子标记，设计特异引物(F:AACTGGGCTAAAGGTCATTACACGG和R TCAGACAGGTGGTGACGCCGCTCAT)。将以全基因组扩增产物稀释50倍作为DNA模板，进行循环数为27的半定量PCR(此方法可以根据电泳条带亮度来比
较基因表达量的高低)。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图2所示，随机挑选的银鲫彩鲫各5个杂交样品都具有十分良好的扩增效果。
[0032]斑马鱼的单拷贝基因分子标记为本领域的常规方案，其余的单拷贝基因分子标记也能完成本专利技术的DNA质量检测。
[0033]6.测序
[0034]随机送20个彩鲫精子和20个银鲫精子杂交胚胎扩增样品进行DNBSEQ T7平台PE
‑
150测序，同时还随机送了采用传统MDA方法扩增的5个彩鲫单精子和20个银鲫单精子样品作为测序对照。
[0035]数据经过滤后，得到的reads用BWA
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mem(V0.7.17)对比到各自的参考基因组(斑马鱼+彩鲫/银鲫)上，并用SMAtools(V1.9)对生成的bam文件进行处理，最后用Ba本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低偏向的单精子全基因组扩增方法，包括：将待测物种的单精子中的DNA人工标记后，将该精子与不同物种的卵子杂交，杂交后，选取512胞或其之前的胚胎，待细胞同步进入有丝分裂中期或末期时，进行DNA取样，测序，与待测物种的全基因组序列进行比对，即可获得单精子全...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，韩笑，李志，周莉，桂建芳，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：