一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系和提取方法技术

本发明专利技术属于生物化学技术领域，公开了一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系及其提取方法。该吸附体系包括组分异硫氰酸胍(0.5～2M，pH5.5～6.5)，无水乙醇1/2～3/2v，羧基磁珠(300nm、终浓度为0.1mg/mL)，2％TritonX

【技术实现步骤摘要】
一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系和提取方法


[0001]本专利技术涉及生物化学
，尤其涉及一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系及其提取方法。

技术介绍

[0002]大豆油是从大豆中压榨提取出来的一种油，是世界上最常用的食用油之一，大豆油中含有多种维持人体重要生理功能的脂肪酸。我国是传统豆制品消费大国，随着我国大豆制品消费需求越来越强，近年来从国外进口至我国的大豆量巨大，整体呈现上升趋势。2021年我国大豆自产量约为1.64*103万吨，进口大豆量高达1.00*104万吨。我国已成为世界上最大的大豆净进口国，进口至我国的大豆主要是转基因大豆，主要用于制取食用豆油，相应豆粕用于饲料加工，或者用作其他产品的加工原料。
[0003][0004]在该背景下，为保证我国转基因标识制度有效实施，促进大豆消费市场健康发展，研发并掌握可靠、准确的大豆转基因检测技术显得尤为重要。而以定性或定量PCR为基础的转基因检测技术的顺利完成则需要理想的DNA模板。
[0005]大豆油加工工序较多，加工工艺涉及破碎、高温加热、高压、吸附、有机溶剂和酸碱处理等多个可致使DNA降解的操作步骤，DNA属于水溶性分子，因此终产品精炼油中DNA含量极低，降解也严重，导致对DNA提取难度大大增加。
[0006]目前对大豆油基因组DNA的提取方法主要有CTAB法和试剂盒法。然而，CTAB法提取效率低下，易引起假阴性误判结果；试剂盒法提取效率亦有待提高，且价格高昂，适用性有限。
[0007]而磁珠法是以磁珠为载体进行核酸提取的新技术，磁珠具有“在高盐低pH溶液环境下吸附核酸，在低盐高pH的溶液环境下洗脱核酸”的特性。利用磁珠这一特点，以一定的溶液条件提供驱动力，可使带负电荷的羧基磁珠吸附核酸，而蛋白质等物质不能吸附于磁珠，从而达到核酸纯化的目的，再利用一定的溶液环境将核酸从磁珠上洗脱下来，就可得到目的核酸溶液。目前市场上涉及到磁珠法都是采用磁珠试剂盒的方式提取核酸，价格较贵。

技术实现思路

[0008]本专利技术为解决现有对大豆油基因组DNA提取过程中所存在的上述技术问题，提供了一种能较大提高得率的用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系及其提取方法，本专利技术直接采用磁珠而非磁珠试剂盒提取核酸，使大豆油中DNA提取的成本大大降低。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]本专利技术的第一个方面是提供一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系，用于油样粗提液中DNA的提取，包括组分：异硫氰酸胍，无水乙醇，羧基磁珠，Triton X
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100，NaCl，适量蒸馏水。
[0011]优选地，所述吸附体系包括如下浓度和用量比的组分：所述异硫氰酸胍(0.5～2M，
pH 5.5～6.5)1mL，无水乙醇1/2～3/2v，羧基磁珠(300nm、终浓度为0.1mg/mL)，2％Triton X
‑
100(v/v)，NaCl(终浓度为2mmol/L)，适量蒸馏水。
[0012]本专利技术研发的由适量异硫氰酸胍、无水乙醇、羧基磁珠、Triton X
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100和NaCl形成的吸附体系，专门用于提取大豆油基因组DNA，能够大大提高大豆油基因组DNA的得率。与现有CTAB法和试剂盒法对大豆油基因组DNA的提取相比，具有提取效率较高、不会引起假阴性误判结果、价格合适和适用性较好的特点。
[0013]本专利技术的第二个方面是提供一种大豆油基因组DNA的提取方法，主要采用如下试剂：
[0014]裂解液(释放DNA)：CTAB裂解液(5％CTAB(w/v)，100mM Tris
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HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％吐温20(v/v)，1％PVP 40(w/v)，pH 8.0)；用于将核酸从细胞中裂解出来。
[0015]结合液(结合DNA)：异硫氰酸胍溶液(0.5～2M，pH5.5～6.5)；用于促进磁珠吸附DNA。
[0016]洗涤液(洗涤DNA)：75～85％乙醇溶液；用于去除磁珠
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DNA复合物上附着的盐离子。
[0017]洗脱液(洗脱DNA)：TE缓冲液(10mM Tris
‑
HCl和1mM EDTA，pH 8.0)；用于将DNA从磁珠上洗脱下来。
[0018]具体地，该大豆油基因组DNA的提取方法，采用上述的吸附体系，主要包括如下步骤：
[0019](A)将CTAB裂解液和油样充分混匀，经离心、破乳使CTAB裂解液和油样分离，向分离后的CTAB裂解液中加入适量异丙醇沉淀DNA，
‑
20℃静置12～18h后，于4℃下16000g离心25min，弃上清，得DNA透明沉淀；
[0020](B)向步骤(A)得到的DNA沉淀中加入适量异硫氰酸胍溶液(结合液)，用于直接溶解DNA沉淀，借助于涡旋混合器充分溶解混匀，涡旋两次，每次5s，然后转入2mL无菌离心管中；
[0021](C)向步骤(B)得到的混合液中加入等体积氯仿
‑
异戊醇溶液，于长轴旋转混匀仪振荡混匀后，12000～14000g常温离心10～15min，转移上清至另一2mL无菌离心管中(抽提步骤)；
[0022](D)向步骤(C)的离心管中加入适量磁珠、无水乙醇、Triton X
‑
100和NaCl后，借助于涡旋混合器涡旋3s，室温下培育10min，培养期间再涡旋一次(结合步骤)；
[0023](E)将步骤(D)中的离心管置于磁性分离器中进行磁性分离，待磁珠聚集且溶液澄清后，吸除溶液，得磁珠
‑
DNA复合物(第一次磁分离)；
[0024](F)将步骤(E)中装有磁珠
‑
DNA复合物的离心管移出磁性分离器，并加入适量乙醇溶液(洗涤液)手动颠倒混匀；
[0025](G)将步骤(F)中的离心管置于磁性分离器中进行二次磁性分离，并吸除乙醇溶液(第二次磁分离)；
[0026](H)重复步骤(F)～(G)洗涤步骤，在室温下干燥3～5min，保证乙醇基本挥发完全(第三次磁分离)；
[0027](I)将步骤(H)中装有晾干的磁珠
‑
DNA复合物的离心管移出磁性分离器，并向离心管中加入适量TE缓冲液(洗脱液)与磁珠充分混合，借助于涡旋混合器涡旋2s，然后在60℃
水浴中培育10min，以洗脱DNA(洗脱步骤)；
[0028](J)将步骤(I)培养后的溶液立即进行磁分离，待磁珠聚集，且溶液澄清后，吸取溶液至600μL无菌离心管中(第四次磁分离)，置
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20℃保存，避免反复冻融，即得大豆油基因组DNA。
[0029]优选地，所述步骤(A)中CTAB裂解液的组成为5％CTAB(w/v)，100mM Tris
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HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％吐温20(v/v)，1％PV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取大豆油基因组DNA的吸附体系，其特征在于，用于油样粗提液中DNA的提取，包括组分：异硫氰酸胍，无水乙醇，羧基磁珠，Triton X
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100，NaCl，适量蒸馏水。2.根据权利要求1所述的吸附体系，其特征在于，包括如下浓度和用量比的组分：异硫氰酸胍(0.5～2M，pH 5.5～6.5)1mL，无水乙醇1/2～3/2v，羧基磁珠(300nm、终浓度为0.1mg/mL)，2％Triton X
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100(v/v)，NaCl(终浓度为2mmol/L)，适量蒸馏水。3.大豆油基因组DNA的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的吸附体系，其包括如下步骤：(A)将CTAB裂解液和油样充分混匀，经离心、破乳使CTAB裂解液和油样分离，向分离后的CTAB裂解液中加入适量异丙醇沉淀DNA，
‑
20℃静置12～18h后，于4℃下16000g离心25min，弃上清，得DNA透明沉淀；(B)向步骤(A)得到的DNA沉淀中加入适量异硫氰酸胍溶液(结合液)，用于直接溶解DNA沉淀，借助于涡旋混合器充分溶解混匀，涡旋两次，每次5s，然后转入2mL无菌离心管中；(C)向步骤(B)得到的混合液中加入等体积氯仿
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异戊醇溶液，于长轴旋转混匀仪振荡混匀后，12000～14000g常温离心10～15min，转移上清至另一2mL无菌离心管中(抽提步骤)；(D)向步骤(C)的离心管中加入适量磁珠、无水乙醇、Triton X
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100和NaCl后，借助于涡旋混合器涡旋3s，室温下培育10min，培养期间再涡旋一次(结合步骤)；(E)将步骤(D)中的离心管置于磁性分离器中进行磁性分离，待磁珠聚集且溶液澄清后，吸除溶液，得磁珠
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DNA复合物(第一次磁分离)；(F)将步骤(E)中装有磁珠
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DNA复合物的离心管移出磁性分离器，并加入适量乙醇溶液(洗涤液)手动颠倒混匀；(G)将步骤(F)中的离心管置于磁性分离器中进行二次磁性分离，并吸除乙醇溶液(第二次磁分离)；(H)重复步骤(F)～(G)洗涤步骤，在室温下干燥3～5min，保证乙醇基本挥发完全(第三次磁分离)；(I)将步骤(H)中装有晾干的磁珠
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DNA复合物的离心管移出磁性分离器，并向离心管中加入适量TE缓冲液(洗脱液)与磁珠充分混合，借助于涡旋混合器涡旋2s，然后在60℃水浴中培育10min，以洗脱DNA(洗脱步骤)；(J)将步骤(I)培养后的溶液立即进行磁分离,待磁珠聚集，且...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈复生，郭梦茹，夏义苗，郝莉花，辛颖，刘伯业，刘晨，高玉航，郑乾坤，郑彦钊，介怡琳，姚飞，吕丁阳，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：