一种用作肺炎克雷伯菌疫苗抗原的融合蛋白KP-Ag2及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用作肺炎克雷伯菌疫苗抗原的融合蛋白KP

【技术实现步骤摘要】
一种用作肺炎克雷伯菌疫苗抗原的融合蛋白KP
‑
Ag2及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用作肺炎克雷伯菌疫苗抗原的融合蛋白KP
‑
Ag2及其应用。

技术介绍

[0002]2017年，世界卫生组织首次发布了严重危害人类健康的12种重点病原体清单，其中，以肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)为代表的肠杆菌科细菌被列为极为重要级别(Tacconelli E,et al.Lancet Infect Dis.2018)。KP为革兰氏阴性菌，是临床上最常见的机会致病菌之一。KP在肠道、鼻咽部以及腋窝等部位均可定植，其中消化道是最主要的定植部位。不同地区的定植率差异较大，西方国家的结肠定植率为5％～35％，而亚洲各国普遍较高，个别国家(如马来西亚)甚至高达85％以上(张欣,等.中华结核和呼吸杂志.2020)。KP可导致全身各部位发生感染，常见于老年患者、营养不良、慢性疾病和全身衰竭的患者，可引起肺炎、尿路感染、脑膜炎、败血症等全身或局部感染(Lee CR,et al.Front Cell Infect Microbiol.2017)。根据毒力和致病特点的不同，目前将KP分为两类，一类是经典肺炎克雷伯菌(cKP)，主要导致医院获得性感染，如肺炎、尿路感染、败血症等，耐药率高，常见于有基础疾病或免疫力低下人群。另一类为高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)，主要导致社区中无基础疾病的健康人群感染，最常见的为肝脓肿，66％由KP感染所致(Russo TA,et al.Clin Microbiol Rev.2019)。
[0003]近年来，KP对各种常见抗生素的耐药形势日趋严峻，2021年CHINET中国细菌耐药监测结果显示，KP的分离率已跃居革兰氏阴性杆菌第二位，仅次于大肠杆菌，在2021年达到19.8％。其对氨苄西林的耐药率已高达91.8％，对哌拉西林的耐药率接近50％。特别是随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)检出率逐年增加，我国KP对亚胺培南和美罗培南耐药率从2005年的3％左右分别上升至2021年的23.1％和24.4％，形式十分严峻(https://www.chinets.com/Document)。不仅如此，KP感染有还有极高的死亡率，据统计：22
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32％的KP所致社区性肺炎患者需要进入ICU治疗，死亡率高达45％
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72％；此外，KP占革兰氏阴性菌感染所致脓毒症病例的5
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20％，死亡率高达27.4％
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37％(Paczosa MK,et al.Microbiol Mol Biol Rev.2016)。更为重要的是，有研究表明对碳青霉烯类抗菌药物敏感的KP感染致死率为20％
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30％，而CRKP感染致死率显著升高，可达40％
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70％(Iredell J,et al.BMJ.2016)，因其超强的耐药性和致病性，CRKP被称为“超级细菌之王”。考虑到其KP耐药形势已十分严峻，尤其是CRKP的广泛流行，使得抗生素治疗难上加难，研发新的有效防治手段迫在眉睫，而疫苗研发是最有前景的策略之一。
[0004]从20世纪70年代出现KP疫苗相关研究以来，多种不同类型的疫苗研究不断出现，早期研究以灭活、减毒和细菌裂解疫苗为主，这些疫苗成分复杂，难以进行质量控制，可能存在残留毒性，基于安全性考虑未能进入临床研究(Ahmad TA,et al.Vaccine.2012)。后来又开始了核糖体疫苗的研究，但由于其为胞内成分，免疫保护性有限，也未能深入研究。其次是多糖疫苗，多糖疫苗采用的抗原主要包括荚膜多糖和LPS，但由于肺炎克雷伯杆菌荚膜
多糖(K
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抗原)有80多种种血清型，LPS(O
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抗原)有12种血清型，K
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抗原和O
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抗原在不同血清型之间变化很大，虽然研究表明这类疫苗在人体试验中表现出良好的免疫原性和安全性，被动免疫也具有较好的保护效果，但其对其它血清型的交叉保护力有限，从客观上限制了其应用(Jenney AW,et al.J Clin Microbiol.2006)。近年来的研究主要集中在重组蛋白疫苗研究方面，多种分泌蛋白和外膜蛋白对KP感染体现出一定的保护作用，如外膜蛋白(OmpA,OmpK36,FepA,OmpK17,OmpW)、Colicin I受体蛋白、粘附素MrkD蛋白、菌毛蛋白、细胞表面铁调控蛋白和类毒素等(Zhang BZ,et al.Front Immunol.2021),是目前最有希望成功的疫苗类型。由于对于肺炎克雷伯菌具有高度特异性的抗原当前进展缓慢，导致当前尚没有可用于诊断和防治肺炎克雷伯菌感染的相关疫苗研发也无突破性进展，尚无特效药物上市。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过反向疫苗学的方法，对肺炎克雷伯菌全基因组进行分析，筛选出潜在的抗原决定簇，对其进行高通量的克隆、表达、纯化，并在动物体内进行保护性评价，从而筛选出了150多种具有保护性的候选抗原，并对其中42种候选抗原进行动物体内保护性评价，从而筛选出了一系列具有保护性的候选抗原。
[0006]针对肺炎克雷伯菌的高感染率、高致病性和高耐药性，本专利技术提供一种用作肺炎克雷伯菌抗原的融合蛋白KP
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Ag2，其可用于制备肺炎克雷伯菌重组亚单位疫苗。
[0007]本专利技术首先提供了一种用作肺炎克雷伯菌抗原的融合蛋白，其由通过以柔性多肽接头连接的KP12蛋白和KP22蛋白构成；其中，所述KP12的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，KP22的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
[0008]在根据本专利技术的一个实施方案中，其具有以下结构：
[0009]KP12
‑
L
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KP22；
[0010]其中，L为选自(GGGGS)
m
和(Gly)
n
中的任一个柔性多肽接头，m选自1
‑
4的整数，n选自6
‑
15的整数；优选为GGGGS。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0012]本专利技术还提供了上述融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。为增加KP
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Ag2在大肠杆菌工程菌内的表达量，本专利技术优化了其DNA编码序列，得到如SEQ ID NO:1所示的编码基因。
[0013]本专利技术进一步提供了一种表达载体，其包含骨架质粒和上述的编码基因。
[0014]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种；优选为pET30a质粒。pET30a质粒具有卡那霉素抗性，可用于阳性重组子的筛选。为方便后续产业化工艺研究，在融合蛋白两端均不引入额外的标签序列。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用作肺炎克雷伯菌疫苗抗原的融合蛋白KP
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Ag2，其特征在于，由通过以柔性多肽接头连接的KP12蛋白和KP22蛋白构成；其中，所述KP12的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，KP22的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，具有以下结构：KP12
‑
L
‑
KP22；其中，L为选自(GGGGS)
m
和(Gly)
n
中的任一个的柔性多肽接头，m选自1
‑
4的整数，n选自6
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8的整数；优选为GGGGS。3.如权利要求1所述的融合蛋白KP
‑
Ag2，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的融合蛋白KP
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Ag2的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。5.一种表达载体，其特征在于，包含骨架质粒和如权利要求2所述的编码基因。6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述骨架质粒选自pGEX系列载体、pET系列载体或pQE系列载体中的任一种；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：章金勇，苟强，张晓丽，陈致富，袁月，敬海明，赵卓，邹全明，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：