一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法技术

本申请涉及生物技术领域，更具体涉及一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法。本申请可显著提高基因敲入效率，适用于不同基因的敲入；可最大程度地减少电转体系组分的取样误差，降低实验误差，增加实验结果的稳定性；对CRISPR/Cas系统的制备浓度要求低；适用于任何电转仪器设备的电转体系。何电转仪器设备的电转体系。何电转仪器设备的电转体系。

【技术实现步骤摘要】
一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法


[0001]本申请涉及生物
，特别涉及一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法。

技术介绍

[0002]基因敲入(Gene knock in)是利用基因同源重组，将外源的功能基因(基因组原先不存在、或已失活的基因)，转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。该技术在基因功能与分子机制的研究、构建人类疾病的动物模型、基因治疗、农业和林业等领域具有重要的应用前景。以TALEN、CRISPR/Cas系统为代表的人工核酸内切酶技术在制备indel(插入或缺失标记)等基因突变体的应用中已较为成熟，但在基因敲入的应用中仍面临着编辑效率低的困境。基因编辑系统的递送策略是影响基因敲入(KI)效率的关键因素之一，为了获得最佳的KI效率，已发展了不同的转染方案，其中，电穿孔转染方法是一种高效的物理方法，可以实现对基因编辑系统高效的细胞内或细胞核内递送，使用细胞范围广，特别是针对难转染的干细胞、神经细胞等。
[0003]电穿孔转染细胞的方法是利用瞬间高压造成细胞膜不稳定，形成电穿孔使得外源DNA、RNA或蛋白等进入细胞。电穿孔转染法是一种物理方法，无生物与化学毒性副作用，安全性高，操作方便，但其转染效率也受多种因素影响，除常规的电压、脉冲时间、电穿次数等因素外，很大程度上还取决于待转染组分的溶液成分。通常情况下，电转仪配有专用的电转液，待转染的组分、细胞和电转液需严格按照特定的比例添加以制备具有最佳转染效率的转染体系，因此对质粒DNA、mRNA或蛋白等待转染物质的制备浓度要求较高，只有待转染物质的浓度极高时，才能在满足转染体系制备比例的情况下，具有足够的量获得较高的编辑效果。同时，在用移液器吸取高浓度待转物质时，由于微量的体积和移液吸头的吸附作用，会导致组分实际用量误差，从而导致转染效率不稳定，影响实验结果。这种转染体系的制备方法要求高、操作也较为繁琐，不利于使用。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，为解决现有技术中电转染效率低，基因敲入不稳定的技术问题，本申请的目的在于提供一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种电转染方法，包括以下步骤：
[0006]1)提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统；
[0007]2)提供靶向目标基因的同源修复模板；
[0008]3)将步骤1)所得的CRISRP/Cas9系统和步骤2)所得的同源修复模板干燥成粉末，得到预处理样品；
[0009]4)将步骤3)中的预处理样品用电转缓冲溶液重悬，与待转入的细胞共孵育，形成
电转染体系；
[0010]5)将步骤4)所得的电转染体系进行电击处理。
[0011]本申请第二方面提供前述的电转染方法用于体外基因敲入的用途。
[0012]与现有技术相比，本申请的有益效果为：
[0013]1、本申请可显著提高基因敲入的效率，适用于不同基因的敲入。
[0014]2、本申请可最大程度地减少电转体系组分的取样误差，降低实验误差，增加实验结果的稳定性。
[0015]3、本申请对CRISPR/Cas系统的制备浓度要求低，不限CRISPR/Cas系统的任何形式。
[0016]4、本申请适用于任何电转仪器设备的电转体系，不限电转设备品牌和型号。
附图说明
[0017]图1显示为pX330质粒图谱。
[0018]图2显示为dsDNA HDR 1％琼脂糖凝胶电泳图。其中，M1表示1000bp DNA marker，M2表示100bp DNA marker，泳道1和泳道2均为对照组DNA，泳道3为dsDNA HDR。
[0019]图3显示为实验组实施例基因敲入效果。
[0020]图4显示为对比例1基因敲入效果。
[0021]图5显示为对比例2基因敲入效果。
具体实施方式
[0022]为了使本申请的专利技术目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。
[0023]本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60～120和80～110的范围，理解为60～110和80～120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1～3、1～4、1～5、2～3、2～4和2～5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0～5”表示本文中已经全部列出了“0～5”之间的全部实数，“0～5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。
[0024]如果没有特别的说明，本申请的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤1)和2)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤1)和2)，也可以包括顺序进行的步骤2)和1)。
[0025]本申请的专利技术人经过大量探索研究，发现了一种提高基因敲入效率的电穿孔转染体系制备方法，显著提高基因敲入效率。在此基础上完成了本申请。
[0026]本申请提供一方面提供一种电转染方法，包括以下步骤：
[0027]1)提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统；
[0028]2)提供靶向目标基因的同源修复模板；
[0029]3)将步骤1)所得的CRISRP/Cas9系统和步骤2)所得的同源修复模板干燥成粉末，得到预处理样品；
[0030]4)将步骤3)中的预处理样品用电转缓冲溶液重悬，与待转入的细胞共孵育，形成电转染体系；
[0031]5)将步骤4)所得的电转染体系进行电击处理。
[0032]本申请所提供的电转染方法中，步骤1)中，CRISPR/Cas9系统包括Cas9和sgRNA。进一步地，CRISPR/Cas9系统包括分别表达Cas9和sgRNA的质粒、Cas9 mRNA和sgRNA，或Cas9 RNP蛋白复合物。更进一步地，表达Cas9的质粒选自pMJ920和pCAG
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T3
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hCAS
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pA。表达sgRNA的质粒选自SP6
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sgRNA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电转染方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统；2)提供靶向目标基因的同源修复模板；3)将步骤1)所得的CRISRP/Cas9系统和步骤2)所得的同源修复模板干燥成粉末，得到预处理样品；4)将步骤3)中的预处理样品用电转缓冲溶液重悬，与待转入的细胞共孵育，形成电转染体系；5)将步骤4)所得的电转染体系进行电击处理。2.如权利要求1所述的电转染方法，其特征在于，步骤1)中，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和sgRNA；优选地，所述CRISPR/Cas9系统包括分别表达Cas9和sgRNA的质粒DNA、Cas9 mRNA和sgRNA，或Cas9 RNP蛋白复合物；更优选地，表达Cas9的质粒选自pMJ920和pCAG
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T3
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hCAS
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pA，表达sgRNA的质粒选自SP6
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sgRNA
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scaffold，Cas9mRNA和sgRNA的mRNA选自pX330、pX458和pX459质粒中的RNA。3.如权利要求2所述的电转染方法，其特征在于，步骤1)中，当CRISPR/Cas9系统为分别表达Cas9和sgRNA的质粒时，表达Cas9的质粒和表达sgRNA的质粒的质量比为1：0.5～4：1；当CRISPR/Cas9系统为Cas9 mRNA和sgRNA时，Cas9 mRNA和sgRNA的质量比为2:1～6:1；当CRISPR/Cas9系统为Cas9 RNP蛋白复合物时...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏凯，周婷，赵建龙，
申请(专利权)人：上海前瞻创新研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：