家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用及其方法技术

本发明专利技术公开了家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用及其方法，通过无缝克隆和同源重组，将分子量超过250kDa的完整Ser4蛋白表达到了蚕茧丝胶层中，育成的转基因品系提高了蚕丝力学性能的提高，过表达Ser4品系的蚕丝更加疏水，蚕茧脱胶率减低，有望应用于多丝胶丝制品的生产。品的生产。品的生产。

【技术实现步骤摘要】
家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用及其方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用，还涉及利用家蚕丝胶蛋白Ser4在提高家蚕丝胶性能的方法。

技术介绍

[0002]蚕丝是人类利用最早、最广泛的天然动物蛋白质纤维。家蚕在生长发育的不同阶段，会吐出不同种类的蚕丝纤维。家蚕幼虫在上簇营茧前要经过四次蜕皮形成五龄幼虫。家蚕在五龄之前的每个龄期的开始和结束时分泌的龄起丝和龄末丝统称为小蚕丝。小蚕丝和蚕茧丝均由丝胶和丝素两个部分构成。丝素是丝的中心成分，约占丝重的70
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80％。丝胶是一种胶状的球蛋白，存在于丝素的外围，约占丝总量的20
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30％。近几十年来，蚕丝产业受到性能优异的合成纤维的冲击，导致其产量持续减少。因此，众多学者致力于开发综合性能更优异的蚕丝。
[0003]随着家蚕基因组图谱的发布以及家蚕分子育种技术体系的建立，为蚕丝遗传改良与素材创新研究奠定了分子与技术基础。近年来，围绕蚕丝性能与家蚕遗传操作已成为丝蛋白研究的热点。2003年，自日本学者建立了以piggyBac转座子为核心的家蚕转基因技术体系后，研究者开始构建能够精确调控家蚕的基因、定向改造蚕丝蛋白与蚕丝性能的遗传操作系统，其中包括基因编辑系统，以及能够在家蚕各个组织中增量表达基因的转基因过表达系统。2013年Zhang等人又报道了一种新的编辑基因CRISPR/Cas9系统，该系统依靠碱基互补配对原则来识别特异性的碱基序列，利用核酸内切酶切割靶标基因。相较于ZFN与TALEN，该系统的特异性大大提高。目前，CRISPR/Cas9系统也已在包括家蚕在内的多个物种中得到广泛的应用。转基因过表达技术也是一种可以高效改造家蚕丝腺与蚕丝性能的方法。与基因编辑技术不同，转基因过表达技术仅在家蚕特定的组织中重组表达功能性的外源靶标蛋白，比较温和，不易对家蚕自身的体质、蚕丝的特性产生重大的影响，借助这些遗传操作系统，研究者成功地改造了蚕丝的性能、赋予了蚕丝新的生物学功能，扩展了蚕丝的应用领域。因此利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和丝腺转基因增量表达系统，研究丝胶蛋白对蚕丝性能的影响，对获得高性能蚕丝具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用，本专利技术利用小蚕丝特有的丝胶蛋白在丝胶中表达，获得力学性能更优良的蚕丝；本专利技术的目的之二在于提供一种提高家蚕丝性能的方法；本专利技术的目的之三在于提供由所述的方法制得的性能提高的蚕丝。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]家蚕丝胶蛋白Ser4在提高家蚕丝性能中的应用，所述家蚕丝胶蛋白Ser4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]本专利技术优选的，所述蚕丝性能为蚕丝力学性能或疏水性。
[0008]2、一种提高家蚕丝性能的方法，将家蚕丝胶蛋白Ser4在家蚕中过表达，获得的转基因阳性个体得到的蚕丝即为性能提高的蚕丝。
[0009]本专利技术优选的，所述过表达的方法是构建含家蚕丝胶蛋白Ser4基因的转基因载体，然后将转基因载体注射家蚕，经过饲养G0代，化蛾交配产卵，荧光筛选G1代蚕卵成功获得了sericin4转基因阳性个体。
[0010]本专利技术优选的，所述转基因载体中含有家蚕中部丝腺特异性表达的sericin1基因的启动子Ser1、Hr3增强子与Ser1PA终止子。
[0011]3、由所述的方法制得的性能提高的蚕丝。
[0012]本专利技术优选的，所述蚕丝中有Ser4蛋白表达。
[0013]本专利技术优选的，所述蚕丝的强度和杨氏模量提高。
[0014]本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过敲除Ser4基因，育成sericin基因功能缺陷，家蚕吐丝减少，力学性能降低的纯合品系；首次证明家蚕小蚕期丝胶蛋白可以影响蚕丝的力学性能。进一步通过无缝克隆和同源重组，实现了将分子量超过250kDa的完整Sericin4蛋白表达到了蚕茧丝胶层中，育成之品系具备以下几个特点：
[0015]1)首次确定小蚕期丝胶蛋白Ser4可以影响蚕丝性能；
[0016]2)不转入外源蛋白的情况下实现了蚕丝力学性能的提高；
[0017]3)过表达Ser4品系的蚕丝更加疏水，蚕茧脱胶率减低，有望应用于多丝胶丝制品的生产。
附图说明
[0018]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0019]图1为转基因品系获得及检测(A：Ser4基因gRNA设计；B：过表达sgRNA载体示意图；C：过表达gRNA品系与过表达Cas9家蚕品系杂交，获得多种编辑形式的杂合体)；
[0020]图2为sericin4基因敲除品系的获得及检测(A：Ser4基因敲除纯合品系编辑形式；B：转录水平检测；C：蚕丝免疫印迹检测；D：丝腺SDS
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PAGE检测)；
[0021]图3为gRNA
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Ser4和Sericin4
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品系小蚕丝力学性能检测(A.gRNA
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Ser4品系小蚕丝应力
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应变曲线；B.Sericin4
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品系小蚕丝应力
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应变曲线；C.gRNA
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Ser4和Sericin4
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品系平均应力应变曲线；D.gRNA
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Ser4和Sericin4
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品系蚕丝强度和延展性比较；显著性差异分析：****p<0.0001)；
[0022]图4为全长sericin4基因的克隆和转基因载体的构建(A.全长sericin4基因克隆示意图；B.Sericin4转基因载体构建。红色框代表检测正确的质粒)。
[0023]图5为转基因载体示意图及阳性个体的筛选(A.Sericin4转基因载体示意图；B.阳性个体筛选；3xp3为眼部特异启动子；DsRed为红色荧光蛋白；SV40为sericin1基因的终止密码子序列；Ser1为sericin1基因的启动子区；Ser4为sericin4基因编码序列；Ser1PA为sericin1基因的poly A终止序列)。
[0024]图6为Sericin4基因转录水平检测(WT:D9L品系；OE:过表达Ser4品系)。
[0025]图7为Ser4蛋白在丝腺和蚕丝中的检测(A:丝腺SDS
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PAGE；B:蚕丝免疫印迹；WT:D9L品系；OE:过表达Ser4品系)。
[0026]图8为转基因品系丝腺、蚕茧和蚕蛹的形态观察(A：丝腺；B：蚕茧；C：雄蛹；D：雌蛹)。
[0027]图9为WT和Over
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sericin4蚕茧丝力学性能检测(A：W本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.家蚕丝胶蛋白Ser4在提高家蚕丝性能中的应用，其特征在于：所述家蚕丝胶蛋白Ser4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蚕丝性能为蚕丝力学性能或疏水性。3.一种提高家蚕丝性能的方法，其特征在于：将家蚕丝胶蛋白Ser4在家蚕中过表达，获得的转基因阳性个体得到的蚕丝即为性能提高的蚕丝。4.根据权利要求3所述提高家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述过表达的方法是构建含家蚕丝胶蛋白Ser4的转基因载体，然后将转基因载体注射家蚕，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，郭凯雨，张晓璐，董照明，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：